Összes szerző

Zákány Florina

az alábbi absztraktok szerzői között szerepel:

Cs. Szabó Bence
A sejtmembrán szterol tartalmának változtatása módosítja a Kv1.3 ioncsatorna lipidtutajok és egyéb membrán mikrodomének közötti megoszlását

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

II. Poszterszekció

P47

A sejtmembrán szterol tartalmának változtatása módosítja a Kv1.3 ioncsatorna lipidtutajok és egyéb membrán mikrodomének közötti megoszlását

Cs. Szabó Bence, Szabó Máté, Zákány Florina, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás

Debreceni Egyetem ÁOK Biofizikai és Sejtbiológia Intézet

A limfociták aktivációjában szerepet játszó Kv1.3 ioncsatornáról ismert, hogy preferenciálisan a lipidtutajokban helyezkedik el. A lipidtutajokban található jelátviteli környezet szerepet tölthet be az ioncsatorna működésének szabályozásában. Munkacsoportunkban korábban kimutatták, hogy a membrán szterol tartalmának szelektív növelése megváltoztatja a Kv1.3 elektrofiziológiai jellemzőit. A töltések során bevitt szterolok és a csatorna kölcsönhatásának pontos mechanizmusa azonban nem ismert.

Célunk volt a membrán szterol tartalmának szelektív manipulálása után a Kv1.3 és a lipidtutajok közötti kolokalizáció vizsgálata. Ehhez HEK-293 sejtekben a koleszterin vagy 7-dehidrokoleszterin (7DHC) mennyiségét növeltük a megfelelő szterol/metil-béta-ciklodextrin (MBCD) komplexekkel, illetve koleszterint vontunk ki a sejtek membránjából MBCD alkalmazásával. Ezután jelöltük a sejtekbe transzfektált Kv1.3-FLAG csatornákat anti-FLAG antitesttel és a lipidtutajokat koleratoxin B alegységével, majd konfokális, illetve stimulált emisszió kioltás (STED) mikroszkóp segítségével felvételeket készítettünk. Kvantitatív képanalízis során meghatároztuk a Kv1.3, illetve tutaj jelölők intenzitásai közötti Pearson-féle korrelációs koefficiens értékét.

Méréseink alapján a kontrollhoz (0,416±0,013, n=27) képest a membrán koleszterin, illetve 7DHC tartalma növelésének hatására a Kv1.3 tutajokkal történő kolokalizációja szignifikánsan (p<0,05) növekedett (koleszterin esetén 0,492±0,013, n=34; 7DHC mellett 0,500±0,015, n=32), míg MBCD kezelés után szignifikánsan csökkent (0,338±0,014, n=30). Konfokális mikroszkópos eredményeinket a nagyobb feloldóképességgel bíró STED mikroszkópiával is megerősítettük (kontroll: 0,274±0,025, n=25; koleszterin: 0,361±0,019, n=32; 7DHC: 0,366±0,019, n=28; MBCD: 0,219±0,022, n=24).

Kísérleteink során kimutattuk, hogy a Kv1.3 membrán mikrodomének közötti megoszlása függ a sejtmembrán szterol tartalmától, ami mediálhatja a szterolok ioncsatornákra kifejtett hatásait.

Hinnah Barbara
Kétpórusú káliumcsatornák porcképződésben betöltött szerepének vizsgálata mechanikailag ingerelt ’high density’ porckultúrákban patch-clamp módszerrel

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

II. Poszterszekció

P56

Kétpórusú káliumcsatornák porcképződésben betöltött szerepének vizsgálata mechanikailag ingerelt ’high density’ porckultúrákban patch-clamp módszerrel 

Hinnah Barbara1,2, Zákány Florina1, Szegeczki Vince2, Juhász Tamás2, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet

A kétpórusú káliumcsatornák (K2P) két pórusdoménnel rendelkeznek, aktivitásukat különböző ingerek (pH, hőmérséklet, mechanikai stimulus, stb.) együttes jelenléte határozza meg. Számos K2P csatorna található a porcsejteken, közülük több expressziója a porcképződési folyamat során dinamikusan változik.

Célunk a K2P csatornák sejtfelszíni jelenlétének azonosítása és expressziójának összehasonlítása patch-clamp technika segítségével kontroll, illetve mechanikailag ingerelt (MS) porckultúrákon. Szelektív gátlószer hiányában az egyes ioncsatornák elkülönítéséhez különböző pH-jú külső oldatokat alkalmaztunk, mivel ismert, hogy a különböző K2P csatornák pH érzékenysége eltérő.

Kísérleteinket 22-24. Hamburger-Hamilton-féle fejlődési stádiumban lévő csirkeembriók végtagtelepeiből izolált primer ’high-density’ (HD) porckultúrákon végeztük. A MS a 2. és a 3. tenyésztési napon, míg a patch-clamp mérések teljes sejt konfigurációban a 3. napon történtek, amikor a chondroprogenitor sejtek differenciációja zajlik. A külső oldat pH-ját 7.32, 6.4 és 8.6 között változtattuk egy gravitáció által hajtott perfúziós rendszer segítségével.

A mérések során a 150 ms hosszúságú, -120 mV-tól +50 mV-ig terjedő feszültségrámpák által kiváltott ionáramok egy feszültség-független és több feszültségfüggő komponensből tevődtek össze. Előbbi a K2P csatornákhoz tartozik, míg utóbbiak a porcsejteken jól leírt NaV és KV áramok. A K2P ionáram megfordulási potenciálja kontroll sejteken -43,3 ± 2,9 mV (n=6), előzetesen mechanikailag ingerelt sejteken -65,4 ± 3,5 mV (n=4) volt. A 8.6-os pH-jú oldat a K2P áram amplitúdóját szignifikánsan lecsökkentette a kontroll oldathoz (pH=7.32) képest, ami részben reverzibilisnek bizonyult, míg a 6.4-es pH-jú oldat nem okozott változást.

Mivel a fenti válasz egyedül a TREK2 K2P csatornára jellemző, PCR és Western blot segítségével tovább vizsgáljuk a TREK2 expressziójának változását a porcképződés folyamata során kontroll és mechanikailag stimulált HD porckultúrákban.

Köszönetnyilvánítás: EFOP-3.6.2-16-2017-00006 LIVE LONGER

Kovács Tamás
A dipólpotenciál mérése membránösszetétel-változással járó betegségek membránbiofizikai modellrendszereiben új áramlási citométeres módszerrel

Aug 27 - kedd

09:55 – 10:10

Sejtanalitika biofizikai megközelítéssel

E7

A dipólpotenciál mérése membránösszetétel-változással járó betegségek membránbiofizikai modellrendszereiben új áramlási citométeres módszerrel

Szabó Máté, Zákány Florina, Cs. Szabó Bence, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás1

1 Debreceni Egyetem Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A membrán dipólpotenciálja (DP) a lipidekhez asszociált interfaciális vízmolekulák, illetve a foszfolipidek és szterolok dipoláris szegmentumainak rendezett térbeli orientációjából ered. A dipólok elrendeződése révén ≈300 mV-os pozitív potenciál jön létre, amely a transzmembrán és felületi potenciáloknál jóval nagyobb intramembrán elektromos erőteret eredményez, befolyásolva a membránfehérjék konformációját és funkcióit. A DP nagyságát főleg a membrán lipidösszetétele, különösen a szterolok mennyisége határozza meg. Elhelyezkedése miatt mérése rendkívül nehéz, erre főleg a feszültségszenzitív di-8-ANEPPS fluorofórt használják spektrofluoriméteres vagy konfokális mikroszkópos excitációs arányméréses assay során. Ezen módszerek azonban jelentős hátrányokkal rendelkeznek, így célul tűztük ki egy új DP mérési módszer kifejlesztését.

Kísérleteink során egy újonnan leírt 3-hidroxiflavon-származék használatával kidolgoztunk és optimalizáltunk egy áramlási citometriás technikát a DP mérésére. Alkalmazásának alapja, hogy excitáció után a fluorofórban gerjesztett állapotú intramolekuláris proton transzfer reakció megy végbe. Az így kialakuló normál és tautomer forma emissziója elkülönül és mivel a két forma relatív előfordulása az intramembrán elektromos erőtér függvénye, a flurofór alkalmas a DP meghatározására emissziós arányméréses assay segítségével.

Ismert DP-t módosító kezelések (phloretin, 6-ketocholestanol) használatával bizonyítottuk módszerünk alkalmazhatóságát, di-8-ANEPPS-sel végzett spektrofluorimetriás referenciamérések mellett. JY lymphoblastoid és THP-1 monocita sejtekben kimutattuk, hogy a membrán koleszterin, illetve 7-dehidro-koleszterin tartalmának metil-β-ciklodextrin/szterol komplexekkel történő növelése dózisfüggő módon növeli a DP nagyságát.

A munkánk során optimalizált új áramlási citometriás módszer alkalmazható nagy mennyiségű élő sejt DP-jának gyors, egyszerű és megbízható mérésére.

Szabó Máté
Szterolok és többszörösen telítetlen zsírsavak dipólpotenciálra gyakorolt hatásának vizsgálata új áramlási citometriás módszerrel

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P2

Szterolok és többszörösen telítetlen zsírsavak dipólpotenciálra gyakorolt hatásának vizsgálata új áramlási citometriás módszerrel

Szabó Máté, Zákány Florina, Cs. Szabó Bence, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás1

1DE ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A dipólpotenciál (DP) +300 mV-os intramembrán potenciál, amely jelentősen befolyásolja a transzmembrán fehérjék konformációját és funkcióit. A membrán szterol tartalmának emelése növeli a DP nagyságát, így hiperkoleszterinémiában (HC), illetve Smith-Lemli-Opitz szindrómában (SLOS), ahol a membrán koleszterin, illetve 7-dehidrokoleszterin (7DHC) tartalma emelkedik, várható a DP patofiziológiai jelentőséggel bíró növekedése. A DP mérésére a legelterjedtebb módszer a di-8-ANEPPS fluorofórt alkalmazó spektrofluoriméteres vagy mikroszkópos excitációs aránymérés, melynek alkalmazhatósága azonban erőteljesen korlátozott, így célunk volt egy hatékony DP mérési módszer fejlesztése és tesztelése a fenti betegségek membránbiofizikai modelljeiben.

Munkánk során kidolgoztunk egy F66 feszültségszenzitív fluorofórt alkalmazó, emissziós aránymérésen (Rem) alapuló áramlási citométeres technikát a DP mérésére, összevetve eredményeinket spektrofluorimetriás referenciaméréseink adataival. Ismert DP-t módosító kezelések (phloretin, 6-ketocholestanol) használatával bizonyítottuk módszerünk alkalmazhatóságát, az F66 Rem negatív korrelációt mutatott a DP nagyságával (szenzitivitás: kb. -15%/100 mV). Ezután JY és THP-1 sejtvonalakon és humán PBMC-ken létrehoztuk a fenti betegségek modelljeit és meghatároztuk a DP nagyságát új módszerünkkel.

A HC, illetve SLOS modelljében kimutattuk, hogy a membrán koleszterin, illetve 7DHC tartalmának növelése a megfelelő metil-béta-ciklodextrin/szterol komplexekkel dózisfüggő módon növelte a DP nagyságát (∆Rem,max -14%, illetve -8%). A HC terápiájában kiegészítésként használt magas telítetlen zsírsav tartalmú diéta hatásának vizsgálata során omega-3 zsírsav alkalmazása dózisfüggően csökkentette, míg omega-6 zsírsav növelte a DP-t (∆Rem,max +10%, illetve -5%).

Új áramlási citometriás módszerünk alkalmazható nagyszámú élő sejt DP-jának gyors, egyszerű és megbízható mérésére és a sejtmembrán összetételének megváltozásával járó betegségek vizsgálatára.

Zákány Florina
Membránszterolok és -ceramidok támadáspontjának meghatározása feszültségkapuzott káliumcsatornákon voltage-clamp fluorometry (TEVCF) módszerrel

Aug 27 - kedd

16:45 – 17:00

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E22

Membránszterolok és -ceramidok támadáspontjának meghatározása feszültségkapuzott káliumcsatornákon voltage-clamp fluorometry (TEVCF) módszerrel

Zákány Florina1, Kovács Tamás1, Panyi György1, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A feszültségkapuzott káliumcsatornák (Kv) egy feszültségszenzor (VSD) és egy pórusdoménből (PD) épülnek fel. A VSD felelős a membránpotenciál érzékeléséért, míg a PD az ionok számára átjárható pórust alakítja ki. Ismert, hogy a membrán koleszterin (hiperkoleszetrinémia, Smith-Lemli-Opitz szindróma), illetve ceramid (Gaucher-kór) tartalmának növelése befolyásolja a Kv csatornák több kapuzási paraméterét. A kísérletek során azt határoztuk meg, hogy ezek a lipidek melyik doménen keresztül hatva fejtik ki elektrofiziológiai hatásaikat, a VSD vagy a PD az elsődleges célpontjuk.

A fenti betegségek membránbiofizikai modelljeinek kialakításához Xenopus laevis oociták membránját töltöttünk metil-béta-ciklodextrin-koleszterin vagy -7-dehidrokoleszterin komplexekkel, valamint C16-ceramiddal, illetve C16-glikozilceramiddal. Az elektrofiziológiai méréseket TEVCF módszerrel végeztük, ami a patch-clamp mérésekkel szemben az ionáramok meghatározásával egyidőben lehetővé teszi a VSD mozgásának monitorozását a VSD extracelluláris részének MTS-TAMRA fluoreszcens festékkel történő jelölését követően. Így egyszerre kapunk információt a PD (G-V görbe, áramkinetika) és a VSD (F-V görbe, fluor. jel kinetika) állapotáról a kapuzási folyamat alatt, ezáltal nemcsak a fent említett lipidek ionáramra gyakorolt elektrofiziológiai hatásai, hanem azok ioncsatornán belüli célpontja (VSD vagy PD) is azonosíthatóvá válnak. A VSD-PD közti csatolás vizsgálatoz az eltérő csatolási mechanizmussal bíró Kv1.3 és Kv10.1 csatornákon végeztük el a kísérleteinket.

Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a szterolok elektrofiziológiai hatásaikat a Kv csatornák PD-jén keresztül fejtik ki. Ezzel szemben a C16-glikozilceramid és C16-ceramid más támadásponttal rendelkezik, méréseink alapján előbbi a PD-n, utóbbi a VSD-n keresztül fejti ki hatását. A ceramidok támadáspontjának további vizsgálatához a két VSD-ből felépülő feszültségkapuzott protoncsatornán (Hv1) tervezünk hasonló méréseket.

Köszönetnyilvánítás: ÚNKP-18-3-IV-DE 54

Zákány Florina
Ioncsatornák Gaucher-kórban megfigyelhető funkcionális eltéréseinek vizsgálata a betegség in vitro modellrendszerében

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P29

Ioncsatornák Gaucher-kórban megfigyelhető funkcionális eltéréseinek vizsgálata a betegség in vitro modellrendszerében

Zákány Florina1, Székelyhidi Virág1, Panyi György1, Kovács Tamás1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

Számos makrofág funkcióban (citokin szekréció, migráció, fagocitózis, NO szintézis) felvetették ioncsatornák (így a Kv1.3, BK, KCa3.1, Hv1 vagy TRPM2) funkcionális szerepét, illetve ismert, hogy a sejtmembránban található lipidek befolyásolják az ioncsatornák működését. Így feltételezhető, hogy az elsősorban a makrofágok kóros működésével, valamint a lizoszomális béta-glükocerebrozidáz enzim deficienciája révén a glikozilceramid felhalmozódásával jellemezhető Gaucher-kórban az ioncsatornák eltérései jelentősek lehetnek a betegség patomechanizmusában, amelyet korábban még nem vizsgáltak. Ezért célunk egy olyan modell kialakítása, amellyel a későbbiekben vizsgálni tudjuk, hogy Gaucher-kórban milyen, ioncsatornákkal összefüggésbe hozható makrofág funkciók sérülnek.

Modellünk kialakítása során THP-1 monocitákat, belőlük differenciáltatott M0, illetve klasszikus (M1), alternatív (M2a) és regulatórikus (M2r) útvonalakon aktivált makrofágokat kezeltünk a betegségben deficiens enzim irreverzibilis gátlószerével, konduritol-B-epoxiddal (CBE), amelynek hatására a szubsztrát glükozilceramid felhalmozódása figyelhető meg előbb a lizoszómák, majd egyéb intracelluláris organellumok membránjában, illetve a sejtmembránban. A különböző koncentrációkban alkalmazott CBE hatására kialakuló enzimgátlás mértékét kolorimetriás módszerrel határoztuk meg, majd áramlási citometria és megfelelő antitestek segítségével meghatároztuk a CBE kezelés hatására a sejtmembrán ceramid és glükozilceramid tartalmában bekövetkező eltérések nagyságát, validálva modellrendszerünket a későbbi funkcionális mérések számára. Differenciációs és aktivációs protokolljaink áramlási citometriával történő tesztelése és optimalizálása után megvizsgáltuk különböző ioncsatorna gátlószerek (TEA, Vm24, paxilline, TRAM-34, ClGBI és flufenamát sav) hatását az eltérő útvonalakon aktivált makrofágok életképességére. Kísérleteinket a fenti ioncsatornák szerepének vizsgálatával folytatjuk különféle makrofág funkciók esetén.

Köszönetnyilvánítás

ÚNKP-18-3-IV-DE 54


Zákány Florina
Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P30

Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

Zákány Florina1, Kovács Tamás1, Sohajda Tamás2, Szente Lajos2, Nagy Péter1, Panyi György1, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 CycloLab Cyclodextrin R & D Laboratory Ltd., Budapest

A ciklodextrinek (CD) hat (αCD), hét (βCD), illetve nyolc (γCD) alfa-D-glükopiranóz-egységből álló ciklikus oligoszacharidok. Alakjuk belül üreges, hidrofób csonkakúp, így képesek gyógyszermolekulákkal és különböző lipidekkel komplexeket képezni. Széles körben alkalmazzák őket gyógyszerekben semleges vivőanyagként, illetve a kutatásban a membrán koleszterintartalmának szelektív csökkentésére (metil-β-ciklodextrin; MβCD). A ciklodextrinek ioncsatornákra kifejtett direkt hatásait korábban nem vizsgálták. Mivel a feszültégkapuzott káliumcsatornák (Kv) számos biológiai folyamatot kontrollálnak, a CD-ek ezen csatornákra gyakorolt direkt hatásaik révén szerepet játszhatnak számos gyógyszer ismert mellékhatásainak kialakításában (pl.immunszupresszió).

Célunk az MβCD, valamint három különböző inverz (hat, hét vagy nyolc 3,6,-anhidroglükózból álló, belül hidrofil, kívül hidrofób) ciklodextrin (iαCD; iβCD; iγCD) direkt ligand hatásainak karakterizálása Kv1.3-on, illetve annak alátámasztása, hogy ez a ligand hatás független a CD-ek koleszterin depletáló és/vagy membránbiofizikai paramétereket módosító képességétől.

A direkt hatások vizsgálatához a patch-clamp méréseket Kv1.3 ioncsatornával es EGFP-vel kotranszfektált CHO sejteken végeztük. A CD-ek 1 és 5 mM-os koncentrációban részben reverzibilsen gátolták a Kv1.3 ionáramot (MβCD< iαCD< iγCD), kivéve az iβCD, aminek nem volt ilyen hatása. A membránbiofizikai mérések során 1 órás inkubációt követően megvizsgáltuk a CD-k hatását a membrán fluiditásra, hidrációra, rendezettségre, illetve kolorimetriásan meghatároztuk a koleszterin kivonás abszolút mértékét. A CD-k közül egyedül az MβCD-nek volt koleszterin depletáló és membránfizikai hatása, az iCD-knek nem.

Ezek alapján elmondható, hogy a CD-knek a membrán koleszterintartalom módosításától független, eddig le nem írt direkt gátló hatással is bírnak a Kv ioncsatornákra, amelynek fontos szerepe lehet a belőlük készült gyógyszerek mellékhatásainak kialakításában.