Összes szerző

Varga Zoltán MTA

az alábbi absztraktok szerzői között szerepel:

Kitka Diána
Extracelluláris vezikula koncentráció meghatározása humán vérplazmában és szérumban on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfiával és mikrofluidikus ellenállás impulzus méréssel

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

II. Poszterszekció

P49

Extracelluláris vezikula koncentráció meghatározása humán vérplazmában és szérumban on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfiával és mikrofluidikus ellenállás impulzus méréssel

Kitka Diána1, Mihály Judith1, Varga Zoltán1

1 Magyar Tudományos Akadémia Természettudományi Kutatóközpont, Anyag-és Környezetkémiai Intézet

Az élő sejtek közötti kommunikáció egyik újonnan felfedezett útvonala az ún. extracelluláris vezikulákon (EVken) keresztüli információcsere, amely az elmúlt évtizedben a kutatások középpontjába került. Az EVk olyan, a sejten kívüli térben található, kettős foszfolipid membránnal határolt, sejt eredetű (nano)struktúrák, amelyek számos információt hordoznak a kibocsátó sejt állapotáról. Az EVk mennyisége és fajtái nagyban függnek az adott egyén fiziológiás és patológiás állapotától, így betegségek korai EV-alapú diagnosztizálása is lehetségessé válhat. A vér az egyik legnagyobb intermedier közeg és egyben a legfontosabb biomarker forrás, ugyanakkor EVk izolálása, detektálása és jellemzése ebből a komplex mátrixból számos nehézségbe ütközik.

Munkánk célja humán vérből izolált EVk meghatározása és jellemzése olyan újszerű technikákkal, mint az on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfia (Flu-SEC) és a mikrofluidikus ellenállás impulzus mérés (MRPS).

A kísérletekhez egészséges önkéntesektől gyűjtöttünk vért szérum (szérum aktivárok) és plazma (K3EDTA, ACD-A) vérvételi csövekbe. A sejtes elemek eltávolítása két centrifugálási lépéssel történt (2x 2500 x g), majd az EVket méretkizárásos kromatográfiával izoláltuk. Az nCS1 MRPS készülékkel (Spectradyne LLC, USA) történő részecskeszám meghatározás a 65 nm – 250 nm és 250 nm – 2000 nm közötti mérettartományban történt. A Flu-SEC mérések egy FP-2020 fluoreszcenciás detektorral összekapcsolt HPLC rendszerrel (Jasco, Japan) történtek egy 4 mL CL-2B géllel töltött méretkizárásos oszlop használatával. A EV minták fluoreszcens jelöléséhez PE-CD61, PE-CD81 és AF488-CD41 antitesteket használtunk.

Az MRPS mérések alapján a szérumban jelentősen magasabb EV koncentráció volt tapasztalható (1010 illetve 7x107 részecske/mL) mint a plazmában (4-6x109 illetve 1-2x107 részecske/mL). A két technika kombinációjával a vérlemezke és az extracelluláris vezikula specifikus fluoreszcens antitestekkel jelölt EVk mértékét is meg tudtuk határozni.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást az NKFIH PD 121326 és NVKP_16-1-2016-0007 pályázatok anyagi támogatásával végeztük. V.Z. munkáját a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj támogatta.

Mihály Judith
Extracelluláris vezikulák IR spektroszkópiája

Aug 27 - kedd

15:20 – 15:40

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E17

Extracelluláris vezikulák IR spektroszkópiája

Mihály Judith, Bebesi Tímea, Kitka Diána, Szentirmai Veronika, Szigyártó Imola Csilla, Bóta Attila, Varga Zoltán

MTA Természettudományi Kutatóközpont, Anyag- és Környezetkémiai Intézet

Az extracelluláris vezikulák (EV-k) az utóbbi években kerültek a tudományos érdeklődés középpontjába: ismertté vált, hogy a sejtek foszfolipid kettősréteggel határolt nanoméretű struktúrákat, ún. extracelluláris vezikulákat bocsájtanak ki, amelyek jelentős szerepet játszanak a sejtek közötti intercelluláris kommunikációban. Bár az EVk kiemelkedő lehetőséggel bírnak, mint betegségmarkerek vagy gyógyszerhordozók, klinikai alkalmazásukhoz szükség van a megfelelő észlelési és jellemzési módszerek kidolgozására. Az infravörös (IR) spektroszkópia – standardizált mérési körülmények és adatfeldolgozási eljárásokkal kiegészítve – egy egyszerű, jelölésmentes módszer lehet EV-k jellemzésére. Bár főként az egyedi vezikulák jellemzésére alkalmas technikák fejlesztése került előtérbe (AFM, lézercsipeszes Raman spektroszkópia), mind orvosdiagnosztikai szempontból, mind a biokémiai jelenségek tanulmányozása céljából szükség van olyan gyors, mintaelőkészítés nélküli módszerekre, amelyek az EVk egy-egy sokaságát tudják specifikusan jellemezni.

A jelen munka során vörösvértestkoncentrátumokban (VVT) ex vivo keletkező EVket (mikrovezikulákat) vizsgáltunk IR spektroszkópiai módszerrel. Az alkalmazott ATR FT-IR technika, valamint a spektrumokból számolt fehérje-lipid arány egy robosztus karakterizálási eljárásnak bizonyult különböző jellegű EV minták megkülönböztetésére. A fehérjék másodlagos szerkezetére, illetve orientációjára utaló IR markerek szintén megfelelő „ujjlenyomatot” szolgáltatnak. A kapott eredmények felhívják a figyelmet arra, hogy bár az alapkutatásban a VVT-eredetű EVket, mint modell-vezikulákat alkalmazzák, ezek minőségére hatással vannak a vörösvértestkoncentrátumok tárolási körülményei (tárolási idő, tárolási adalék). A vérkészítményekben az öregedés/tárolás során keletkező és felgyülemlő EVk - gyulladás-indukáló hatásuk miatt - károsan befolyásolhatják a vérkészítmények további felhasználhatóságát; az IR spektroszkópia alkalmas lehet ezen EVk gyors jellemzésére.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást az NVKP_16-1-2016-0007 pályázat anyagi támogatásával végeztük.