Összes szerző

Varga Zoltán

az alábbi absztraktok szerzői között szerepel:

Cs. Szabó Bence
A sejtmembrán szterol tartalmának változtatása módosítja a Kv1.3 ioncsatorna lipidtutajok és egyéb membrán mikrodomének közötti megoszlását

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

II. Poszterszekció

P47

A sejtmembrán szterol tartalmának változtatása módosítja a Kv1.3 ioncsatorna lipidtutajok és egyéb membrán mikrodomének közötti megoszlását

Cs. Szabó Bence, Szabó Máté, Zákány Florina, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás

Debreceni Egyetem ÁOK Biofizikai és Sejtbiológia Intézet

A limfociták aktivációjában szerepet játszó Kv1.3 ioncsatornáról ismert, hogy preferenciálisan a lipidtutajokban helyezkedik el. A lipidtutajokban található jelátviteli környezet szerepet tölthet be az ioncsatorna működésének szabályozásában. Munkacsoportunkban korábban kimutatták, hogy a membrán szterol tartalmának szelektív növelése megváltoztatja a Kv1.3 elektrofiziológiai jellemzőit. A töltések során bevitt szterolok és a csatorna kölcsönhatásának pontos mechanizmusa azonban nem ismert.

Célunk volt a membrán szterol tartalmának szelektív manipulálása után a Kv1.3 és a lipidtutajok közötti kolokalizáció vizsgálata. Ehhez HEK-293 sejtekben a koleszterin vagy 7-dehidrokoleszterin (7DHC) mennyiségét növeltük a megfelelő szterol/metil-béta-ciklodextrin (MBCD) komplexekkel, illetve koleszterint vontunk ki a sejtek membránjából MBCD alkalmazásával. Ezután jelöltük a sejtekbe transzfektált Kv1.3-FLAG csatornákat anti-FLAG antitesttel és a lipidtutajokat koleratoxin B alegységével, majd konfokális, illetve stimulált emisszió kioltás (STED) mikroszkóp segítségével felvételeket készítettünk. Kvantitatív képanalízis során meghatároztuk a Kv1.3, illetve tutaj jelölők intenzitásai közötti Pearson-féle korrelációs koefficiens értékét.

Méréseink alapján a kontrollhoz (0,416±0,013, n=27) képest a membrán koleszterin, illetve 7DHC tartalma növelésének hatására a Kv1.3 tutajokkal történő kolokalizációja szignifikánsan (p<0,05) növekedett (koleszterin esetén 0,492±0,013, n=34; 7DHC mellett 0,500±0,015, n=32), míg MBCD kezelés után szignifikánsan csökkent (0,338±0,014, n=30). Konfokális mikroszkópos eredményeinket a nagyobb feloldóképességgel bíró STED mikroszkópiával is megerősítettük (kontroll: 0,274±0,025, n=25; koleszterin: 0,361±0,019, n=32; 7DHC: 0,366±0,019, n=28; MBCD: 0,219±0,022, n=24).

Kísérleteink során kimutattuk, hogy a Kv1.3 membrán mikrodomének közötti megoszlása függ a sejtmembrán szterol tartalmától, ami mediálhatja a szterolok ioncsatornákra kifejtett hatásait.

Hinnah Barbara
Kétpórusú káliumcsatornák porcképződésben betöltött szerepének vizsgálata mechanikailag ingerelt ’high density’ porckultúrákban patch-clamp módszerrel

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

II. Poszterszekció

P56

Kétpórusú káliumcsatornák porcképződésben betöltött szerepének vizsgálata mechanikailag ingerelt ’high density’ porckultúrákban patch-clamp módszerrel 

Hinnah Barbara1,2, Zákány Florina1, Szegeczki Vince2, Juhász Tamás2, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet

A kétpórusú káliumcsatornák (K2P) két pórusdoménnel rendelkeznek, aktivitásukat különböző ingerek (pH, hőmérséklet, mechanikai stimulus, stb.) együttes jelenléte határozza meg. Számos K2P csatorna található a porcsejteken, közülük több expressziója a porcképződési folyamat során dinamikusan változik.

Célunk a K2P csatornák sejtfelszíni jelenlétének azonosítása és expressziójának összehasonlítása patch-clamp technika segítségével kontroll, illetve mechanikailag ingerelt (MS) porckultúrákon. Szelektív gátlószer hiányában az egyes ioncsatornák elkülönítéséhez különböző pH-jú külső oldatokat alkalmaztunk, mivel ismert, hogy a különböző K2P csatornák pH érzékenysége eltérő.

Kísérleteinket 22-24. Hamburger-Hamilton-féle fejlődési stádiumban lévő csirkeembriók végtagtelepeiből izolált primer ’high-density’ (HD) porckultúrákon végeztük. A MS a 2. és a 3. tenyésztési napon, míg a patch-clamp mérések teljes sejt konfigurációban a 3. napon történtek, amikor a chondroprogenitor sejtek differenciációja zajlik. A külső oldat pH-ját 7.32, 6.4 és 8.6 között változtattuk egy gravitáció által hajtott perfúziós rendszer segítségével.

A mérések során a 150 ms hosszúságú, -120 mV-tól +50 mV-ig terjedő feszültségrámpák által kiváltott ionáramok egy feszültség-független és több feszültségfüggő komponensből tevődtek össze. Előbbi a K2P csatornákhoz tartozik, míg utóbbiak a porcsejteken jól leírt NaV és KV áramok. A K2P ionáram megfordulási potenciálja kontroll sejteken -43,3 ± 2,9 mV (n=6), előzetesen mechanikailag ingerelt sejteken -65,4 ± 3,5 mV (n=4) volt. A 8.6-os pH-jú oldat a K2P áram amplitúdóját szignifikánsan lecsökkentette a kontroll oldathoz (pH=7.32) képest, ami részben reverzibilisnek bizonyult, míg a 6.4-es pH-jú oldat nem okozott változást.

Mivel a fenti válasz egyedül a TREK2 K2P csatornára jellemző, PCR és Western blot segítségével tovább vizsgáljuk a TREK2 expressziójának változását a porcképződés folyamata során kontroll és mechanikailag stimulált HD porckultúrákban.

Köszönetnyilvánítás: EFOP-3.6.2-16-2017-00006 LIVE LONGER

Kitka Diána
Extracelluláris vezikula koncentráció meghatározása humán vérplazmában és szérumban on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfiával és mikrofluidikus ellenállás impulzus méréssel

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

II. Poszterszekció

P49

Extracelluláris vezikula koncentráció meghatározása humán vérplazmában és szérumban on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfiával és mikrofluidikus ellenállás impulzus méréssel

Kitka Diána1, Mihály Judith1, Varga Zoltán1

1 Magyar Tudományos Akadémia Természettudományi Kutatóközpont, Anyag-és Környezetkémiai Intézet

Az élő sejtek közötti kommunikáció egyik újonnan felfedezett útvonala az ún. extracelluláris vezikulákon (EVken) keresztüli információcsere, amely az elmúlt évtizedben a kutatások középpontjába került. Az EVk olyan, a sejten kívüli térben található, kettős foszfolipid membránnal határolt, sejt eredetű (nano)struktúrák, amelyek számos információt hordoznak a kibocsátó sejt állapotáról. Az EVk mennyisége és fajtái nagyban függnek az adott egyén fiziológiás és patológiás állapotától, így betegségek korai EV-alapú diagnosztizálása is lehetségessé válhat. A vér az egyik legnagyobb intermedier közeg és egyben a legfontosabb biomarker forrás, ugyanakkor EVk izolálása, detektálása és jellemzése ebből a komplex mátrixból számos nehézségbe ütközik.

Munkánk célja humán vérből izolált EVk meghatározása és jellemzése olyan újszerű technikákkal, mint az on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfia (Flu-SEC) és a mikrofluidikus ellenállás impulzus mérés (MRPS).

A kísérletekhez egészséges önkéntesektől gyűjtöttünk vért szérum (szérum aktivárok) és plazma (K3EDTA, ACD-A) vérvételi csövekbe. A sejtes elemek eltávolítása két centrifugálási lépéssel történt (2x 2500 x g), majd az EVket méretkizárásos kromatográfiával izoláltuk. Az nCS1 MRPS készülékkel (Spectradyne LLC, USA) történő részecskeszám meghatározás a 65 nm – 250 nm és 250 nm – 2000 nm közötti mérettartományban történt. A Flu-SEC mérések egy FP-2020 fluoreszcenciás detektorral összekapcsolt HPLC rendszerrel (Jasco, Japan) történtek egy 4 mL CL-2B géllel töltött méretkizárásos oszlop használatával. A EV minták fluoreszcens jelöléséhez PE-CD61, PE-CD81 és AF488-CD41 antitesteket használtunk.

Az MRPS mérések alapján a szérumban jelentősen magasabb EV koncentráció volt tapasztalható (1010 illetve 7x107 részecske/mL) mint a plazmában (4-6x109 illetve 1-2x107 részecske/mL). A két technika kombinációjával a vérlemezke és az extracelluláris vezikula specifikus fluoreszcens antitestekkel jelölt EVk mértékét is meg tudtuk határozni.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást az NKFIH PD 121326 és NVKP_16-1-2016-0007 pályázatok anyagi támogatásával végeztük. V.Z. munkáját a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj támogatta.

Kovács Tamás
A dipólpotenciál mérése membránösszetétel-változással járó betegségek membránbiofizikai modellrendszereiben új áramlási citométeres módszerrel

Aug 27 - kedd

09:55 – 10:10

Sejtanalitika biofizikai megközelítéssel

E7

A dipólpotenciál mérése membránösszetétel-változással járó betegségek membránbiofizikai modellrendszereiben új áramlási citométeres módszerrel

Szabó Máté, Zákány Florina, Cs. Szabó Bence, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás1

1 Debreceni Egyetem Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A membrán dipólpotenciálja (DP) a lipidekhez asszociált interfaciális vízmolekulák, illetve a foszfolipidek és szterolok dipoláris szegmentumainak rendezett térbeli orientációjából ered. A dipólok elrendeződése révén ≈300 mV-os pozitív potenciál jön létre, amely a transzmembrán és felületi potenciáloknál jóval nagyobb intramembrán elektromos erőteret eredményez, befolyásolva a membránfehérjék konformációját és funkcióit. A DP nagyságát főleg a membrán lipidösszetétele, különösen a szterolok mennyisége határozza meg. Elhelyezkedése miatt mérése rendkívül nehéz, erre főleg a feszültségszenzitív di-8-ANEPPS fluorofórt használják spektrofluoriméteres vagy konfokális mikroszkópos excitációs arányméréses assay során. Ezen módszerek azonban jelentős hátrányokkal rendelkeznek, így célul tűztük ki egy új DP mérési módszer kifejlesztését.

Kísérleteink során egy újonnan leírt 3-hidroxiflavon-származék használatával kidolgoztunk és optimalizáltunk egy áramlási citometriás technikát a DP mérésére. Alkalmazásának alapja, hogy excitáció után a fluorofórban gerjesztett állapotú intramolekuláris proton transzfer reakció megy végbe. Az így kialakuló normál és tautomer forma emissziója elkülönül és mivel a két forma relatív előfordulása az intramembrán elektromos erőtér függvénye, a flurofór alkalmas a DP meghatározására emissziós arányméréses assay segítségével.

Ismert DP-t módosító kezelések (phloretin, 6-ketocholestanol) használatával bizonyítottuk módszerünk alkalmazhatóságát, di-8-ANEPPS-sel végzett spektrofluorimetriás referenciamérések mellett. JY lymphoblastoid és THP-1 monocita sejtekben kimutattuk, hogy a membrán koleszterin, illetve 7-dehidro-koleszterin tartalmának metil-β-ciklodextrin/szterol komplexekkel történő növelése dózisfüggő módon növeli a DP nagyságát.

A munkánk során optimalizált új áramlási citometriás módszer alkalmazható nagy mennyiségű élő sejt DP-jának gyors, egyszerű és megbízható mérésére.

Mihály Judith
Extracelluláris vezikulák IR spektroszkópiája

Aug 27 - kedd

15:20 – 15:40

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E17

Extracelluláris vezikulák IR spektroszkópiája

Mihály Judith, Bebesi Tímea, Kitka Diána, Szentirmai Veronika, Szigyártó Imola Csilla, Bóta Attila, Varga Zoltán

MTA Természettudományi Kutatóközpont, Anyag- és Környezetkémiai Intézet

Az extracelluláris vezikulák (EV-k) az utóbbi években kerültek a tudományos érdeklődés középpontjába: ismertté vált, hogy a sejtek foszfolipid kettősréteggel határolt nanoméretű struktúrákat, ún. extracelluláris vezikulákat bocsájtanak ki, amelyek jelentős szerepet játszanak a sejtek közötti intercelluláris kommunikációban. Bár az EVk kiemelkedő lehetőséggel bírnak, mint betegségmarkerek vagy gyógyszerhordozók, klinikai alkalmazásukhoz szükség van a megfelelő észlelési és jellemzési módszerek kidolgozására. Az infravörös (IR) spektroszkópia – standardizált mérési körülmények és adatfeldolgozási eljárásokkal kiegészítve – egy egyszerű, jelölésmentes módszer lehet EV-k jellemzésére. Bár főként az egyedi vezikulák jellemzésére alkalmas technikák fejlesztése került előtérbe (AFM, lézercsipeszes Raman spektroszkópia), mind orvosdiagnosztikai szempontból, mind a biokémiai jelenségek tanulmányozása céljából szükség van olyan gyors, mintaelőkészítés nélküli módszerekre, amelyek az EVk egy-egy sokaságát tudják specifikusan jellemezni.

A jelen munka során vörösvértestkoncentrátumokban (VVT) ex vivo keletkező EVket (mikrovezikulákat) vizsgáltunk IR spektroszkópiai módszerrel. Az alkalmazott ATR FT-IR technika, valamint a spektrumokból számolt fehérje-lipid arány egy robosztus karakterizálási eljárásnak bizonyult különböző jellegű EV minták megkülönböztetésére. A fehérjék másodlagos szerkezetére, illetve orientációjára utaló IR markerek szintén megfelelő „ujjlenyomatot” szolgáltatnak. A kapott eredmények felhívják a figyelmet arra, hogy bár az alapkutatásban a VVT-eredetű EVket, mint modell-vezikulákat alkalmazzák, ezek minőségére hatással vannak a vörösvértestkoncentrátumok tárolási körülményei (tárolási idő, tárolási adalék). A vérkészítményekben az öregedés/tárolás során keletkező és felgyülemlő EVk - gyulladás-indukáló hatásuk miatt - károsan befolyásolhatják a vérkészítmények további felhasználhatóságát; az IR spektroszkópia alkalmas lehet ezen EVk gyors jellemzésére.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást az NVKP_16-1-2016-0007 pályázat anyagi támogatásával végeztük.

Papp Ferenc
A feszültség-kapuzott Hv1 protoncsatorna VCF jelének eredete

Aug 27 - kedd

11:25 – 11:45

Molekuláris biofizika

E10

A feszültség-kapuzott Hv1 protoncsatorna VCF jelének eredete

Papp Ferenc, Pethő Zoltán, Bagosi Adrienn, Panyi György, Varga Zoltán

Debreceni Egyegyetem, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A VCF (Voltage Clamp Fluorometry) technika egy nagyon hatékony módszer a membránpotenciál megváltozását érzékelni képes fehérjék konformáció-változásának a vizsgálatára. Ezt a technikát több labor már sikerrel alkalmazta feszültség-kapuzott ioncsatornák vizsgálatára, beleértve a Hv1-et is. Azonban csupán feltételezések vannak arra vonatkozóan, hogy mi is az oka annak, hogy a vizsgált fehérjéhez kapcsolt fluoreszcens festék által emittált fluoreszcencia intenzitásában változás történi a VCF-mérés során. A célunk az volt, hogy feltételezések helyett pontosabban meg tudjuk mondani, hogy a VCF jel mitől alakul ki, és ezáltal pontosabban megérthessük a vizsgált fehérje konformáció-változását.

A VCF méréseinket olyan Ci-Hv1 protoncsatornán végeztük, amelyben a 241-es pozícióban lévő Glu aminosav Cys-re van cserélve. Ehhez a Cys-hez kötődik az a Tamra-MTS fluoreszcens festék, amely érzékeny a lokális környezetére és ezáltal képes információt adni számunkra a fehérje konformáció-változásairól. Miután megvizsgáltuk a Hv1 csatorna aminosav-szekvenciáját, két lehetséges fluoreszcenciát kioltó aminosavat találtunk az extracelluláris oldalon. Ezeket Ala-ra mutáltuk és néztük, hogyan változik a VCF jelünk.

Bármelyik kioltó aminosavat mutáltuk Ala-ra (az Ala aminosav nem képes kioltani a fluoreszcenciát), kisebb VCF jelet mértünk. Ha mindkét fluoreszcenciát kioltó aminosavat elmutáltuk Ala-ra, semmilyen változást (jelet) nem voltunk képesek mérni. Ezek az eredményeink az jelzik, hogy a VCF jelünk kialakulásáért a Tamra-MTS festék közelében lévő fluoreszcenciát kioltó aminosavak a felelősek. További bizonyítékul szolgálhatna még, ha a fluoreszcenciát kioltó aminosavat másik, szintén kioltó aminosavra mutálnánk. Azonban már ezen ismeretek birtokában is elkezdtük egy modell kidolgozását, amelyben a legegyszerűbb, egyenes vonalú mozgását feltételezzük a Tamra festéknek a kioltó aminosavakhoz képest. Az előzetes modell-számításaink segítségével jól reprodukálhatók a mért eredményeink.

Szabó Máté
Szterolok és többszörösen telítetlen zsírsavak dipólpotenciálra gyakorolt hatásának vizsgálata új áramlási citometriás módszerrel

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P2

Szterolok és többszörösen telítetlen zsírsavak dipólpotenciálra gyakorolt hatásának vizsgálata új áramlási citometriás módszerrel

Szabó Máté, Zákány Florina, Cs. Szabó Bence, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás1

1DE ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A dipólpotenciál (DP) +300 mV-os intramembrán potenciál, amely jelentősen befolyásolja a transzmembrán fehérjék konformációját és funkcióit. A membrán szterol tartalmának emelése növeli a DP nagyságát, így hiperkoleszterinémiában (HC), illetve Smith-Lemli-Opitz szindrómában (SLOS), ahol a membrán koleszterin, illetve 7-dehidrokoleszterin (7DHC) tartalma emelkedik, várható a DP patofiziológiai jelentőséggel bíró növekedése. A DP mérésére a legelterjedtebb módszer a di-8-ANEPPS fluorofórt alkalmazó spektrofluoriméteres vagy mikroszkópos excitációs aránymérés, melynek alkalmazhatósága azonban erőteljesen korlátozott, így célunk volt egy hatékony DP mérési módszer fejlesztése és tesztelése a fenti betegségek membránbiofizikai modelljeiben.

Munkánk során kidolgoztunk egy F66 feszültségszenzitív fluorofórt alkalmazó, emissziós aránymérésen (Rem) alapuló áramlási citométeres technikát a DP mérésére, összevetve eredményeinket spektrofluorimetriás referenciaméréseink adataival. Ismert DP-t módosító kezelések (phloretin, 6-ketocholestanol) használatával bizonyítottuk módszerünk alkalmazhatóságát, az F66 Rem negatív korrelációt mutatott a DP nagyságával (szenzitivitás: kb. -15%/100 mV). Ezután JY és THP-1 sejtvonalakon és humán PBMC-ken létrehoztuk a fenti betegségek modelljeit és meghatároztuk a DP nagyságát új módszerünkkel.

A HC, illetve SLOS modelljében kimutattuk, hogy a membrán koleszterin, illetve 7DHC tartalmának növelése a megfelelő metil-béta-ciklodextrin/szterol komplexekkel dózisfüggő módon növelte a DP nagyságát (∆Rem,max -14%, illetve -8%). A HC terápiájában kiegészítésként használt magas telítetlen zsírsav tartalmú diéta hatásának vizsgálata során omega-3 zsírsav alkalmazása dózisfüggően csökkentette, míg omega-6 zsírsav növelte a DP-t (∆Rem,max +10%, illetve -5%).

Új áramlási citometriás módszerünk alkalmazható nagyszámú élő sejt DP-jának gyors, egyszerű és megbízható mérésére és a sejtmembrán összetételének megváltozásával járó betegségek vizsgálatára.

Zákány Florina
Membránszterolok és -ceramidok támadáspontjának meghatározása feszültségkapuzott káliumcsatornákon voltage-clamp fluorometry (TEVCF) módszerrel

Aug 27 - kedd

16:45 – 17:00

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E22

Membránszterolok és -ceramidok támadáspontjának meghatározása feszültségkapuzott káliumcsatornákon voltage-clamp fluorometry (TEVCF) módszerrel

Zákány Florina1, Kovács Tamás1, Panyi György1, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A feszültségkapuzott káliumcsatornák (Kv) egy feszültségszenzor (VSD) és egy pórusdoménből (PD) épülnek fel. A VSD felelős a membránpotenciál érzékeléséért, míg a PD az ionok számára átjárható pórust alakítja ki. Ismert, hogy a membrán koleszterin (hiperkoleszetrinémia, Smith-Lemli-Opitz szindróma), illetve ceramid (Gaucher-kór) tartalmának növelése befolyásolja a Kv csatornák több kapuzási paraméterét. A kísérletek során azt határoztuk meg, hogy ezek a lipidek melyik doménen keresztül hatva fejtik ki elektrofiziológiai hatásaikat, a VSD vagy a PD az elsődleges célpontjuk.

A fenti betegségek membránbiofizikai modelljeinek kialakításához Xenopus laevis oociták membránját töltöttünk metil-béta-ciklodextrin-koleszterin vagy -7-dehidrokoleszterin komplexekkel, valamint C16-ceramiddal, illetve C16-glikozilceramiddal. Az elektrofiziológiai méréseket TEVCF módszerrel végeztük, ami a patch-clamp mérésekkel szemben az ionáramok meghatározásával egyidőben lehetővé teszi a VSD mozgásának monitorozását a VSD extracelluláris részének MTS-TAMRA fluoreszcens festékkel történő jelölését követően. Így egyszerre kapunk információt a PD (G-V görbe, áramkinetika) és a VSD (F-V görbe, fluor. jel kinetika) állapotáról a kapuzási folyamat alatt, ezáltal nemcsak a fent említett lipidek ionáramra gyakorolt elektrofiziológiai hatásai, hanem azok ioncsatornán belüli célpontja (VSD vagy PD) is azonosíthatóvá válnak. A VSD-PD közti csatolás vizsgálatoz az eltérő csatolási mechanizmussal bíró Kv1.3 és Kv10.1 csatornákon végeztük el a kísérleteinket.

Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a szterolok elektrofiziológiai hatásaikat a Kv csatornák PD-jén keresztül fejtik ki. Ezzel szemben a C16-glikozilceramid és C16-ceramid más támadásponttal rendelkezik, méréseink alapján előbbi a PD-n, utóbbi a VSD-n keresztül fejti ki hatását. A ceramidok támadáspontjának további vizsgálatához a két VSD-ből felépülő feszültségkapuzott protoncsatornán (Hv1) tervezünk hasonló méréseket.

Köszönetnyilvánítás: ÚNKP-18-3-IV-DE 54

Zákány Florina
Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P30

Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

Zákány Florina1, Kovács Tamás1, Sohajda Tamás2, Szente Lajos2, Nagy Péter1, Panyi György1, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 CycloLab Cyclodextrin R & D Laboratory Ltd., Budapest

A ciklodextrinek (CD) hat (αCD), hét (βCD), illetve nyolc (γCD) alfa-D-glükopiranóz-egységből álló ciklikus oligoszacharidok. Alakjuk belül üreges, hidrofób csonkakúp, így képesek gyógyszermolekulákkal és különböző lipidekkel komplexeket képezni. Széles körben alkalmazzák őket gyógyszerekben semleges vivőanyagként, illetve a kutatásban a membrán koleszterintartalmának szelektív csökkentésére (metil-β-ciklodextrin; MβCD). A ciklodextrinek ioncsatornákra kifejtett direkt hatásait korábban nem vizsgálták. Mivel a feszültégkapuzott káliumcsatornák (Kv) számos biológiai folyamatot kontrollálnak, a CD-ek ezen csatornákra gyakorolt direkt hatásaik révén szerepet játszhatnak számos gyógyszer ismert mellékhatásainak kialakításában (pl.immunszupresszió).

Célunk az MβCD, valamint három különböző inverz (hat, hét vagy nyolc 3,6,-anhidroglükózból álló, belül hidrofil, kívül hidrofób) ciklodextrin (iαCD; iβCD; iγCD) direkt ligand hatásainak karakterizálása Kv1.3-on, illetve annak alátámasztása, hogy ez a ligand hatás független a CD-ek koleszterin depletáló és/vagy membránbiofizikai paramétereket módosító képességétől.

A direkt hatások vizsgálatához a patch-clamp méréseket Kv1.3 ioncsatornával es EGFP-vel kotranszfektált CHO sejteken végeztük. A CD-ek 1 és 5 mM-os koncentrációban részben reverzibilsen gátolták a Kv1.3 ionáramot (MβCD< iαCD< iγCD), kivéve az iβCD, aminek nem volt ilyen hatása. A membránbiofizikai mérések során 1 órás inkubációt követően megvizsgáltuk a CD-k hatását a membrán fluiditásra, hidrációra, rendezettségre, illetve kolorimetriásan meghatároztuk a koleszterin kivonás abszolút mértékét. A CD-k közül egyedül az MβCD-nek volt koleszterin depletáló és membránfizikai hatása, az iCD-knek nem.

Ezek alapján elmondható, hogy a CD-knek a membrán koleszterintartalom módosításától független, eddig le nem írt direkt gátló hatással is bírnak a Kv ioncsatornákra, amelynek fontos szerepe lehet a belőlük készült gyógyszerek mellékhatásainak kialakításában.