Összes szerző

Vámosi György

az alábbi absztraktok szerzői között szerepel:

Kenesei Ádám
Interleukin-15 transz-prezentáció tanulmányozása fluoreszcencia mikroszkópiával

Aug 27 - kedd

16:00 – 16:15

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E19

Interleukin-15 transz-prezentáció tanulmányozása fluoreszcencia mikroszkópiával

Kenesei Ádám¹, Szalóki Nikoletta¹, Hegedűs Éva¹, Volkó Julianna¹, Waldmann Thomas A.², Vámosi György¹

¹ Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² National Institutes of Health Lymphoid Malignancies Branch

Interleukin-15 (IL-15) citokin jelentős szerepet játszik a természetes és adaptív immunrendszer szabályozásában. A szintézis fő helyszínei a dendritikus sejtek és monociták. Az IL-15 receptor (IL-15R) három alegységből (IL-15Rα, IL-2/15Rβ, γc) épül fel. Az IL-15 elsősorban transz-prezentáció útján biztosítja a jelátvitelt. Professzionális antigén prezentáló sejtek (APC-k) - amelyek expresszálják az IL-15-öt és az azt megkötő IL-15Rα alegységet – prezentálják a ligandot a célsejten jelenlévő β és γc alegységeknek. Felvetődik a kérdés, hogy az APC antigént kötő fő hisztokompatibilitás komplexe (MHC II) és a T sejten elhelyezkedő T sejt receptor (TCR) kölcsönhatása révén lejátszódó antigén-felismerés szerepet játszik-e a transz-prezentációban. Ennek tanulmányozásához az IL-15Rα-t stabilan kifejező Raji B-sejtvonalat, valamint a β és γc alegységeket kifejező Jurkat T-sejtvonalat használtunk. Ha a Raji sejteket Staphylococcus Enterotoxin E szupernatigénnel (SEE) kezeljük, az SEE-t kötő MHC II molekula stabil immunológiai szinapszist alakít ki a Jurkat sejten lévő TCR-rel, így tanulmányozhatóvá válik az MHC II-TCR interakció hatása az IL-15 transz-prezentációra. A transz-prezentáció kimutatására Förster rezonancia energia transzfer (FRET) méréseket végeztünk a β és α alegységek között. Az IL-15Rα mCherry fluoreszcens fehérjével jelölt formában (N-terminálison) expresszálódik a Raji sejteken, az IL-2/15Rβ alegységet Alexa488-Mikβ3 antitesttel jelöltük. A FRET mérések közvetlenül bizonyítják az IL-2/15Rβ és IL-15Rα alegységek összeszerelődését transz-prezentáció során. Az alegységek közt mérhető FRET megnőtt az MHC II-TCR interakció hatására. Transzprezentáció során mind az IL-15Rα, mind az IL-2/15Rβ alegység feldúsul a szinapszisban, azonban SEE és IL-15 szimultán kezelés hatására ez a feldúsulás kisebb mértékű.

Lina Fadel
Impact of agonist treatment on RXR partner selection

Aug 26 - hétfő

09:40 – 09:55

Sejtanalitika biofizikai megközelítéssel

E6

Impact of agonist treatment on RXR partner selection

Lina Fadel¹, Laszlo Nagy^2,3,4, György Vámosi¹

¹Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, Debrecen, Hungary.

²Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, Debrecen, Hungary

³UD-Genomed, Debrecen, Hungary.

⁴Departments of Medicine and Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine and Johns Hopkins All Children's Hospital, St. Petersburg, FL, USA. lnagy@jhmi.edu.

Retinoid X Receptor (RXR) plays a pivotal role as a transcription regulator. It serves as an obligatory heterodimerization partner for many other nuclear receptors (NRs). Activation of RXR heterodimers exert a transcriptional activity controlling a wide variety of important biological processes such as development, differentiation, metabolism and cell death. NRs share a common structure composed of several functional domains: an N-terminal transcription activation function domain; a DNA-binding domain; a flexible hinge region domain; and a C-terminal ligand binding domain. The mechanism of activation called molecular switch is also common between these receptors. In this study we intended to understand how the promiscuous RXR molecule behaves in the presence of several potential heterodimeric partners and ligands. We hypothesized that there is a competition between RXR partners for binding to RXR and binding of a specific agonist increases the affinity of a given receptor to RXR. Our hypothesis was tested with three partners of RXR: PPARγ, RAR,VDR using nuclear translocation assay in a three-color model system. The competition was evaluated detecting changes in heterodimerization between RXR and one of its partners, NR1, in the presence of another competing partner, NR2. Therefore, NR1 was needed in a form that is distributed evenly in the cell when expressed alone and enriched in the nucleus when interacting with RXR. These conditions were fulfilled by wt. VDR and mutant forms of both PPARγ and RAR lacking their NLS. Our data revealed that RXR binds to its unliganded partners with different affinities; highest for RAR, lowest for VDR and moderate for PPARγ while specific agonist treatment tips the scale in favor of the liganded partner.

This work was undertaken to a better understanding of RXR partition between its different heterodimeric and to obtain insight into triggering specific signaling pathway in complicating cellular environments.

Mocsár Gábor
Fehérjeklaszterek T sejtek membránjában és blebjein

Aug 27 - kedd

16:15 – 16:30

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E20

Fehérjeklaszterek T sejtek membránjában és blebjein

Mocsár Gábor¹, Zubánics-Nagy Áron¹, Volkó Julianna¹, Tóth Katalin², Waldmann Thomas A. ⁴, Wieser Stefan³, Vereb György¹, Schütz Gerhard³, Bodnár Andrea¹, Vámosi György¹

¹ Debreceni Egyetem, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

²German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany

³Institute of Applied Physics, Vienna University of Technology

⁴Lymphoid Malignancies Branch, National Cancer Institute, Bethesda, USA

A membránfehérjékből felépülő sejtfelszíni struktúrák változatos térbeli és időbeli szerkezettel rendelkeznek, több hierarchikus szinten szerveződnek. Az immunfolyamatokban fontos szereppel rendelkező interleukin-2 és -15 citokin receptorok és az MHC I és II molekulák közös klaszterekben fejeződnek ki T sejtek membránjában. Tápanyag megvonás hatására a sejteken apoptotikus/nekrotikus membrán hólyagok, blebek alakulnak ki, a nagyméretű blebek membránja nem rendelkezik citoszkeletális kapcsolatokkal, azokat citoszkeleton mentes modellmembránnak használtuk.

Kísérleteinkben arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a citoszkeleton hiánya, a fehérjék mobilitásának a növekedése, illetve a membrán mikrodomén szerkezetének megváltozása a blebeken hogyan hat az MHC I, MHC II, valamint az IL-2Rα és IL-15Rα- alegységek klaszterméreteire, homo- illetve heteroasszociációjára, a fehérje-fehérje kölcsönhatások stabilak maradnak-e a citoszkeleton hiányában.

Az ép sejtfelszínen, illetve a blebek felszínén a receptorok és molekulák klaszterméreteinek meghatározását szuperfeloldású STED képek analízisével végeztük el. A közös komplexekben levő fehérjék arányát fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópiával vizsgáltuk meg. A fehérjék homo- és heteroasszociációit többcsatornás fluoreszcencia intenzitásmérésen alapuló mikroszkópos FRET méréssel jellemeztük.

Méréseink szerint, 40 nm-es feloldás mellett, a blebek felszínén fehérjeeloszlások homogének, nem volt jele magasabb szintű szerveződésnek, illetve mikrodomének jelenlétének. A mérési eredmények alapján megállapítható, hogy a fehérjék aránya a közös komplexekben, valamint ezen fehérjeasszociációk stabilitása független a citoszkeletonnal való kapcsolattól és a magasabb szerveződésű sejtmembrán eltűnésétől.

Nizsalóczki Enikő
Az IL-9R és IL-2R térbeli kapcsolatának kvantitatív analízise humán T limfóma sejteken

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P22

Az IL-9R és IL-2R térbeli kapcsolatának kvantitatív analízise humán T limfóma sejteken

Nizsalóczki Enikő¹, Nagy Péter¹, Mocsár Gábor¹, Szabó Ágnes¹, Csomós István¹, Thomas A. Waldmann², Vámosi György¹, Mátyus László¹, Bodnár Andrea¹

¹ DE ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² Lymphoid Malignancies Branch, National Institutes of Health, Bethesda, USA

Az interleukin-9 (IL-9) egy multifunkcionális citokin, amelynek a T sejtek onkogenezisében betöltött szerepére egyre több adat utal. A heterodimer IL-9R komplexet a citokin-specifikus α-lánc és a közös γc alegység alkotja. Ez utóbbi alegység más citokinreceptorok, így a T sejt funkció szabályozásában központi szerepet betöltő IL-2R felépítésében is részt vesz. Konfokális mikroszkópiás képek Pearson-féle korrelációs analízisével korábban feltártuk az IL-9R és IL-2R kettős térbeli viszonyát humán T limfóma sejteken: míg a sejtek egy részében a két receptorfajta közös klaszterek kialakításában vesz részt, más sejtekre szegregált membrándoménekben történő elhelyezkedésük a jellemző. Jelen vizsgálatainkban tovább elemeztük a két receptorfajta térbeli kapcsolatát a Kit225/IL-9R humán T limfóma sejtvonalon. A konfokális mikroszkópiás képek elemzése során a Pearson-féle korrelációs együttható meghatározását kiegészítettük a Manders-féle co-occurance (együttes előfordulás) analízissel. Kimutattuk, hogy az IL-9 és IL-2 receptorok egy minimális, ám a véletlen által generálttól szignifikánsan magasabb hányadának ko-lokalizációja az összességében negatív korrelációt mutató (a két receptorfajtát döntően elkülönülő membránterületeken kifejező) sejteken is megfigyelhető. FRET kísérleteink igazolták az IL-9/IL-2R rendszer elemeinek molekuláris szintű (1-10 nm) közelségét, azaz az alegységek közös klasztereinek jelenlétét. IL-9 kötődés hatására a FRET hatásfokok módosultak, ami az IL-9/IL-2R rendszer elemeinek konformáció változására és/vagy a receptor alegységek térbeli átrendeződésére utalhat. Hipotézisünk szerint az IL-9R és IL-2R általánosan előforduló klaszterei az IL-9/IL-9R jelátvitelhez szükséges „hot spot”-ként szolgálhatnak, amely elősegíti a közös receptor alegységek és jelátviteli molekulák optimális felhasználását és a megfelelő receptor komplexek összeszerelődését.

Rehó Bálint
Magreceptorok mobilitásának és dimerizációjának vizsgálata élő sejtekben SPIM-FCCS és FRET segítségével

Aug 27 - kedd

09:25 – 09:40

Sejtanalitika biofizikai megközelítéssel

E5

Magreceptorok mobilitásának és dimerizációjának vizsgálata élő sejtekben SPIM-FCCS és FRET segítségével

Rehó Bálint¹, Lukas Lau², Mocsár Gábor¹, Jan Wolfgang Krieger², Jörg Langowski², Tóth Katalin², Vámosi György¹

¹ Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² German Cancer Research Center, Biophysics of Macromolecules

A magreceptorok szupercsaládjába olyan fehérjék tartoznak, amelyek ligandfüggő módon képesek szabályozni célgénjeik átírását. Kutatásunk során a retinoid receptorok családjába tartozó reténsav receptor (RAR) és a retinoid X receptor (RXR) kölcsönhatásait vizsgáljuk élő sejtekben. Működésüket a molekuláris kapcsoló modell írja le. Ezek a receptorok ligand hiányában DNS-hez kapcsolódva korepresszor komplexet kötnek és gátolják célgénjeik átíródását. A modell szerint agonista ligand hatására (az A vitamin származékai) a receptorok konformációváltozáson mennek keresztül, melynek során koregulátor csere történik és a korepresszor komplex aktivátor komplexre cserélődik. Ezt a modellt a területen zajló intenzív kutatások eredményeképp egyre dinamikusabb kép kezdi felváltani.

Vizsgálataink során arra voltunk kíváncsiak, hogyan változik a magreceptorok mobilitása és egymáshoz való affinitásuk ligand jelenlétében és hiányában.

Kísérleteink során HeLa sejtekbe transzfektáltunk fluoreszcens proteinekkel (GFP, mCherry) jelölt magreceptorokat. A mobilitásban bekövetkező változásokat fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiával (FCS) követtük nyomon. Heidelbergi kollaborációs partnereinknél fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópiával (FCCS) kombinált Selective Plane Illumination Mikroszkópiai (SPIM) méréseket végeztünk⁽¹⁾. A sejtekről készült SPIM képeken FRET analízist is végrehajtottunk, hogy tovább növeljük méréseink információtartalmát.

Vizsgálataink kimutatták, hogy a receptorok mobilitása agonista ligand hatására csökken, valamint sikerült megmutatnunk azt is, hogy a két receptor kotranszfekciója ligand nélkül is a mobilitás csökkenéséhez vezet. Bebizonyítottuk továbbá, hogy egyes receptor-komplexek csak az egyik fél felől aktiválhatóak.⁽²⁾

SPIM-F(C)CS-el kombinált FRET vizsgálataink egy igen komplex rendszer képét kezdik kirajzolni, és segíthetnek feltárni a magreceptorok aktivációjában és dimerziációjában szerepet játszó molekuláris mechanizmusokat.

Köszönetnyilvánítás

GINOP-2.3.2-15-2016-00026, DAAD #273478

Irodalom

[1] Krieger, J. W., Singh, A. P., Bag, N., Garbe, C. S., Saunders, T. E., Langowski, J., & Wohland, T. (2015). Imaging fluorescence (cross-) correlation spectroscopy in live cells and organisms. Nature Protocols, 10(12), 1948-1974.

[2] Brazda, P., Krieger, J., Daniel, B., Jonas, D., Szekeres, T., Langowski, J., Vamosi, G. (2014). Ligand Binding Shifts Highly Mobile Retinoid X Receptor to the Chromatin-Bound State in a Coactivator-Dependent Manner, as Revealed by Single-Cell Imaging. Molecular and Cellular Biology, 34(7), 1234-1245.

Volkó Julianna
Új intracelluláris jelátviteli mechanizmus? Interleukin receptor összeszerelődés az ER-ben és a Golgi-ban

Aug 27 - kedd

16:30 – 16:45

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E21

Új intracelluláris jelátviteli mechanizmus? Interleukin receptor összeszerelődés az ER-ben és a Golgi-ban

Volkó Julianna¹, Kenesei Ádám¹, Mocsár Gábor¹, Várnai Péter², Tóth Katalin³, Waldmann Thomas A.⁴, Vámosi György¹

¹ Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² Semmelweis Egyetem, ÁOK, Élettani Intézet

³German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany

⁴NIH, CCR, Lymphoid Malignancies Branch, Bethesda MD, USA

Az interleukin-2 és -15 citokinek központi szerepet töltenek be az immunrendszer szabályozásában, kontrollálva a limfociták túlélését és apoptózisát, meghatározó jelentőségűek különböző leukémiákban és autoimmun betegségekben. Heterotrimer receptoraik a sejtmembránban ligandspecifikus, saját α-alegységekkel rendelkeznek, ugyanakkor a jelátvivő β- és γc-láncokat közösen használják. A sejtfelszínen kifejeződő receptor láncokat célzó anti-IL-2Rα (daclizumab) terápiákkal, melyek a T sejt proliferáció gátlására irányulnak, csekély siker érhető el felnőttkori T sejtes leukémiában (ATL) és sclerosis multiplex-ben. Kiváncsiak voltunk, vajon az IL-2R alegységek képesek-e összeszerelődni így hatékony jelátvitelt lehetővé tenni már az endoplazmatikus retikulumban (ER) és/vagy a Golgi-ban, mielőtt a sejtfelszínre jutnak.

Az EGFP vagy mCherry fluoreszcens fehérjével jelölt receptor láncok összeszerelődését a szekréciós úton (az ER és a Golgi területén) élő HeLa sejtekben vizsgáltuk konfokális mikroszkópiás intenzitás-alapú Förster rezonancia energia transzfer (FRET) mérések segítségével.

Az ER-ben és a Golgi-ban is sikerült energiatranszfert mérni a β- és a γc-, valamint a β- és az IL-2Rα- ill. IL-15Rα alegységek között. Az IL-2Rα heteroasszociációját az IL-15Rα-val és a γc-láncok homoasszociációját szintén kimutattuk ezekben a sejtorganellumokban. A β-IL-2Rα/IL-15Rα és az IL-2Rα-IL-15Rα heteroasszociációkat jellemző energiatranszfer hatásfokok szignifikánsan magasabbak voltak a plazmamembránban, mint az ER-ben vagy a Golgi-ban, ami arra utal, hogy a szekréciós út során történő részleges asszociáció után, az alegységek összeszerelődése a sejtfelszínen fejeződik be.

IL-2-termelő T sejtekben a jelátvitel végbemehet az ER/Golgi-ban előre összeszerelődött receptorok által. Eredményeink rávilágíthatnak az intracelluláris autokrin jelátvitel egy új paradigmájára ill. magyarázatot adhatnak a sejtfelszíni receptorokat célzó antagonista antitest terápiák rezisztenciájára.