Összes szerző

Panyi György

az alábbi absztraktok szerzői között szerepel:

Csóti Ágota
Rekombináns peptid toxinok előállítása Escherichia coli-ban

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P19

Rekombináns peptid toxinok előállítása Escherichia coli-ban

Csóti Ágota¹, Dorothy Wai² Raymund S. Norton² és Panyi György¹

¹ Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² Monash University (Australia), Monash Institute of Pharmaceutical Sciences

A „peptides to drugs” nemzetközi trenddel összhangban számos ioncsatorna gátló peptid terápiás hatását ismertük meg a közelmúltban, pl. az autoimmun betegségek esetén a nagy affinitású és szelektivitású Kv1.3 K+ csatorna gátló skorpió toxinokét. Egy toxin farmakológiai karakterizálásához, illetve a szerkezet-funkció összefüggés megismeréséhez nagy mennyiségű peptidre van szükség, de az állatokból nyerhető toxin mennyisége limitált. Célom olyan lejárás kidolgozása, ami lehetővé teszi a 3-4 diszulfid híddal rendelkező peptidek natív szerkezetben történő előállítását bakteriális expressziós rendszerben.

A peptid-toxinok rekombináns termelésével a peptidet nagy mennyiségben és költséghatékonyan lehet előállítani. Gondot jelet azonban a 3-4 diszulfid híd kialakítása, amihez speciális reduktív környezet kell. Az eljárást az Anuroctoxin (AnTx, 35 aminosavból álló peptid toxin) előállítására optimalizáltam, mely toxin részletes farmakológiai vizsgálatát laboratóriumunk végezte el. Kísérleteink során az anuroctoxint tioredoxin címkével ellátott fúziós fehérjeként állítottuk elő. A tioredoxin címke jelentősen hozzájárult a peptid „folding” mechanizmusához, biztosítva a folyamathoz szükséges reduktív környezetet. Ezt követően N¹⁵ jelölésre módosított eljárással NMR szerkezetvizsgálatra alkalmas peptidet kívánok előállítani. [1]

Végeredményben olyan toxin molekulát állítottunk elő, mely megfelel az elvárásoknak mind gazdasági és biológiai szempontok alapján, továbbá kiemelkedő biológiai azonossággal és kémiai tisztasággal jellemezhető, illetve képes helyettesíteni a vad típusú toxin molekulát.

Irodalom

[1] Chang, Shih Chieh, et al. "N-terminally extended analogues of ShK as potent and selective blockers of the voltage-gated potassium channel Kv1. 3." The FEBS journal 282.12 (2015): 2247.

Papp Ferenc
A feszültség-kapuzott Hv1 protoncsatorna VCF jelének eredete

Aug 27 - kedd

11:25 – 11:45

Molekuláris biofizika

E10

A feszültség-kapuzott Hv1 protoncsatorna VCF jelének eredete

Papp Ferenc, Pethő Zoltán, Bagosi Adrienn, Panyi György, Varga Zoltán

Debreceni Egyegyetem, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A VCF (Voltage Clamp Fluorometry) technika egy nagyon hatékony módszer a membránpotenciál megváltozását érzékelni képes fehérjék konformáció-változásának a vizsgálatára. Ezt a technikát több labor már sikerrel alkalmazta feszültség-kapuzott ioncsatornák vizsgálatára, beleértve a Hv1-et is. Azonban csupán feltételezések vannak arra vonatkozóan, hogy mi is az oka annak, hogy a vizsgált fehérjéhez kapcsolt fluoreszcens festék által emittált fluoreszcencia intenzitásában változás történi a VCF-mérés során. A célunk az volt, hogy feltételezések helyett pontosabban meg tudjuk mondani, hogy a VCF jel mitől alakul ki, és ezáltal pontosabban megérthessük a vizsgált fehérje konformáció-változását.

A VCF méréseinket olyan Ci-Hv1 protoncsatornán végeztük, amelyben a 241-es pozícióban lévő Glu aminosav Cys-re van cserélve. Ehhez a Cys-hez kötődik az a Tamra-MTS fluoreszcens festék, amely érzékeny a lokális környezetére és ezáltal képes információt adni számunkra a fehérje konformáció-változásairól. Miután megvizsgáltuk a Hv1 csatorna aminosav-szekvenciáját, két lehetséges fluoreszcenciát kioltó aminosavat találtunk az extracelluláris oldalon. Ezeket Ala-ra mutáltuk és néztük, hogyan változik a VCF jelünk.

Bármelyik kioltó aminosavat mutáltuk Ala-ra (az Ala aminosav nem képes kioltani a fluoreszcenciát), kisebb VCF jelet mértünk. Ha mindkét fluoreszcenciát kioltó aminosavat elmutáltuk Ala-ra, semmilyen változást (jelet) nem voltunk képesek mérni. Ezek az eredményeink az jelzik, hogy a VCF jelünk kialakulásáért a Tamra-MTS festék közelében lévő fluoreszcenciát kioltó aminosavak a felelősek. További bizonyítékul szolgálhatna még, ha a fluoreszcenciát kioltó aminosavat másik, szintén kioltó aminosavra mutálnánk. Azonban már ezen ismeretek birtokában is elkezdtük egy modell kidolgozását, amelyben a legegyszerűbb, egyenes vonalú mozgását feltételezzük a Tamra festéknek a kioltó aminosavakhoz képest. Az előzetes modell-számításaink segítségével jól reprodukálhatók a mért eredményeink.

Tajti Gábor
Ioncsatorna expressziós eltérések vizsgálata in vitro polarizált T-sejteken

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P26

Ioncsatorna expressziós eltérések vizsgálata in vitro polarizált T-sejteken

Tajti Gábor¹, Szántó G. Tibor¹, Csóti Ágota¹, Rácz Gréta¹, Bagosi Adrienn¹, Paholcsek Melinda², Tolnai Emese², Panyi György¹

¹ Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² Debreceni Egyetem ÁOK, Humángenetikai Tanszék

A T-sejtek memória funkciójuk szerinti ioncsatorna (Kv1.3, KCa3.1) expressziós különbségei régóta ismertek [1], azonban az kevéssé ismeretes, hogy a T-helper-Treg altípusok között milyen eltérések fedezhetők fel. Állatkísérletes adatok utalnak különbségekre [2], humán vizsgálatok eddig azonban nem ismeretesek. Révén, hogy számtalan betegség patofiziológiájában kiemelt szerepűek egyes T-sejt altípusok, célul tűztük ki ezen sejtek ioncsatorna expressziójának jellemzését, esetleges terápiás célpontok azonosítása céljából.

Vizsgálatainkhoz egészséges önkéntesek véréből CD4⁺ T-sejteket izoláltunk, melyeket polarizáló citokin-aktivátor környezetben Th1 és Treg irányba differenciáltattunk. A sejtpopulációkat tovább dúsítottuk mágneses bead alapú eljárásokkal, majd patch-clamp és Kalcium imaging technikákkal jellemeztük azok ioncsatornáit, továbbá génexpressziós vizsgálatokat végeztünk (RT-qPCR).

Előzetes eredményeink alapján a Kv1.3 funkcionális expressziója szignifikánan magasabb a Th1 sejtekben a Treg-hez viszonyítva (914/sejt vs. 260/sejt), a KCa3.1 szintje nem mutatott ilyen különbségeket (62/sejt vs. 42/sejt). A Kv1.3 csatorna biofizikai paraméterei (aktivációs és inaktivációs időállandók, V_1/2, stb) nem különböztek. Génexpressziós szinten is felfedezhetők különbségek, a Th1 esetén a T-bet, míg a Treg esetén a FOXP3 transzkripciós faktorok a várt emelkedett expressziót mutatják, azonban az ioncsatorna gének jellemzése további adatelemzést kíván.

További terveink között szerepel a kalcium imaging mérések elemzése, mellyel a kalcium homeosztázis különbségeit kívánjuk jellemezni, valamit további T-sejt altípusok vizsgálata (Th2, Th17). Eddigi eredményeink alapján felfedezhetők expressziós különbségek a T-sejt altípusok ioncsatorna repertoárjában, mely lehetőséget adhat azok terápiás kihasználására.

Köszönetnyilvánítás

GINOP-2.3.2-15-2016-00015 I-KOM TEAMING.

Irodalom

[1] Wulff et al., J.Clin.Invest., 2003, 111:1703-1713

Török Ferenc
A Pterinochilus murinus venom hatása feszültség függő nátrium és kálium ioncsatornákra

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P27

A Pterinochilus murinus venom hatása feszültség függő nátrium és kálium ioncsatornákra

Török Ferenc¹, Tanya Kushwahaa^1,2, Török Enikő³, Papp Ferenc^1,2, Panyi György², Hajdu Péter^1,2

¹ Debreceni Egyetem ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² Debreceni Egyetem FOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

³ Debreceni Egyetem ÁOK, Humángenetika Tanszék

Az elmúlt pár évtizedben a gyógyszertervezés során előtérbe kerültek az állatfajok (kígyók, skorpiók, pókok) által szekretált peptidek, mint lehetséges templátok. Jelen projektünkben a kenyai Usambara-hegységben elterjedt Pterinochilus murinus madárpók által termelt méreg (PMCV) ioncsatornákra kifejtett farmakológiai hatását vizsgálatuk meg.

A vizsgálatok során kb. 20 darab, 3-4 éves egyed került havi szinten fejésre, ezzel biztosítva számukra a megfelelő exkréciós időtartamot. A méreg kinyerése TENS készülékkel történt, majd a mérget liofilizáltuk és felhasználásig -20 C-on tároltuk. Az ioncsatornák áramát patch-clamp technikával teljes-sejt vagy outside-out konfigurációban határoztuk meg. Az ioncsatornákat HEK-293 sejteken expresszáltattuk.

Eredményeink azt mutatták, hogy a 0.1 mg/ml koncentrációban alkalmazott PMCV az Nav1.3 és Nav1.5 nátrium ioncsatorna inaktivációs kinetikáját lassította, viszont az áramamplitúdót nem módosította. Továbbá az Nav1.4 csatornát működését nem befolyásolta a PMCV. Ezzel szemben a Kv2.1 kálium csatorna áramát gátolta a PMCV, viszont a kapuzási paramétereket nem befolyásolta.

Jövőbeni terveink között szerepel a méreg HPLC-n történő frankcionálása, majd az aktív frakciók azonosítása. Funkcionális vizsgálataink során a toxinok akciós potenciálra kifejtett hatását fogjuk meghatározni.

Köszönetnyilvánítás:

NKFIH-K128525, ÚNKP-18-DE-149 és Bolyai János Kutatási Ösztöndíj (H.P.), NKFIH-K119417 (P.Gy.), EFOP-3.6.1-16-2016-00022 (P. F. és T.F.)

Vörös Orsolya
Az Orai1 ioncsatorna immunológiai szinapszisba történő berendőzédésének molekuláris háttere

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P28

Az Orai1 ioncsatorna immunológiai szinapszisba történő berendőzédésének molekuláris háttere

Vörös Orsolya¹, Panyi György¹, Hajdu Péter²

¹ Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet, Debrecen

² Debreceni Egyetem, FOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet, Debrecen

A CRAC csatornáknak kiemelt szerepe van a T-limfocita aktivációhoz szükséges Ca2+ jel kialakításában. A CRAC csatorna két szerkezeti egységből épül fel: az ER membránjában található STIM1-ből és a plazmamembránbeli Orai1-ből; melyek a T-sejt APC-vel történő találkozása során kialakuló immunológiai szinapszisban (IS) felhalmozódnak. Továbbá ismert, hogy aktin-kötő fehérjék (HS1/WASp/WAVE2) - melyek felelősek lehetnek az ioncsatornák IS-beli kihorgonyzásáért - az IS-ben feldúsulnak, valamint géncsendesítésük gátolja az IS kialakulását és a Ca2+- függő jelátviteli útvonalat a T sejtben. Ezek alapján feltételezzük, hogy az aktin-kötő fehérjék részt vesznek a CRAC csatorna kihorganyzásában az IS-ben, mely fontos a megfelelő Ca2+-jel kialakításához a T-sejt aktiváció során.

GST affinitás kromatográfiát alkalmazva kimutattuk, hogy a HS1, amely egy aktin-regulátor fehérje, képes kötődni az Orai1 csatorna N-terminálisához. Az mGFP-vel jelölt, vad típusú illetve különböző N-terminális deléciós mutáns (Orai1-N1-74: 1-74, Orai1-N2-88: 1-88) csatornákat stabilan expresszáló Jurkat T sejteket CD3-CD28 beaddel konjugáltatva immunológiai szinapszist hoztunk létre, majd különböző időpillanatokban (1, 5, 15, 30, 60 perc) meghatároztuk az Orai1 és a HS1 IS-beli feldúsulását és kolokalizációját. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy hasonlóan a vad típusú Orai1 csatornához, az Orai1 N-terminális rövidebb szakaszának eltávolítása (Orai1-N1-74) esetén az Orai1 továbbra is képes a HS1-gyel kolokalizálódni az IS-ben a T sejtekben, azonban a feldúsulás mértéke alacsonyabb illetve lassabb kinetikát mutat a vad típusú csatornához képest. Az N-terminális nagyobb részének eltávolítása (Orai1-N2-88) során az Orai1 IS-beli feldúsulása elmaradt, és nem mutatott HS1 kolokalizációt.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az Orai1-HS1 interakció szerepet játszik az Orai1 csatorna IS-beli kihorganyzásában amely befolyásolhatja a Ca2+ -jel kialakulását a T-sejt aktivációja során.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az NKFIH-K128525, ÚNKP-18-DE-149, NKFIH-K119417, GINOP-2.3.2-15-2016-00044, EFOP-3.6.2-16-2017-00006, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00009 támogatta.

Zákány Florina
Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P30

Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

Zákány Florina¹, Kovács Tamás¹, Sohajda Tamás², Szente Lajos², Nagy Péter¹, Panyi György¹, Varga Zoltán¹

¹ Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² CycloLab Cyclodextrin R & D Laboratory Ltd., Budapest

A ciklodextrinek (CD) hat (αCD), hét (βCD), illetve nyolc (γCD) alfa-D-glükopiranóz-egységből álló ciklikus oligoszacharidok. Alakjuk belül üreges, hidrofób csonkakúp, így képesek gyógyszermolekulákkal és különböző lipidekkel komplexeket képezni. Széles körben alkalmazzák őket gyógyszerekben semleges vivőanyagként, illetve a kutatásban a membrán koleszterintartalmának szelektív csökkentésére (metil-β-ciklodextrin; MβCD). A ciklodextrinek ioncsatornákra kifejtett direkt hatásait korábban nem vizsgálták. Mivel a feszültégkapuzott káliumcsatornák (Kv) számos biológiai folyamatot kontrollálnak, a CD-ek ezen csatornákra gyakorolt direkt hatásaik révén szerepet játszhatnak számos gyógyszer ismert mellékhatásainak kialakításában (pl.immunszupresszió).

Célunk az MβCD, valamint három különböző inverz (hat, hét vagy nyolc 3,6,-anhidroglükózból álló, belül hidrofil, kívül hidrofób) ciklodextrin (iαCD; iβCD; iγCD) direkt ligand hatásainak karakterizálása Kv1.3-on, illetve annak alátámasztása, hogy ez a ligand hatás független a CD-ek koleszterin depletáló és/vagy membránbiofizikai paramétereket módosító képességétől.

A direkt hatások vizsgálatához a patch-clamp méréseket Kv1.3 ioncsatornával es EGFP-vel kotranszfektált CHO sejteken végeztük. A CD-ek 1 és 5 mM-os koncentrációban részben reverzibilsen gátolták a Kv1.3 ionáramot (MβCD< iαCD< iγCD), kivéve az iβCD, aminek nem volt ilyen hatása. A membránbiofizikai mérések során 1 órás inkubációt követően megvizsgáltuk a CD-k hatását a membrán fluiditásra, hidrációra, rendezettségre, illetve kolorimetriásan meghatároztuk a koleszterin kivonás abszolút mértékét. A CD-k közül egyedül az MβCD-nek volt koleszterin depletáló és membránfizikai hatása, az iCD-knek nem.

Ezek alapján elmondható, hogy a CD-knek a membrán koleszterintartalom módosításától független, eddig le nem írt direkt gátló hatással is bírnak a Kv ioncsatornákra, amelynek fontos szerepe lehet a belőlük készült gyógyszerek mellékhatásainak kialakításában.

Zákány Florina
Ioncsatornák Gaucher-kórban megfigyelhető funkcionális eltéréseinek vizsgálata a betegség in vitro modellrendszerében

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P29

Ioncsatornák Gaucher-kórban megfigyelhető funkcionális eltéréseinek vizsgálata a betegség in vitro modellrendszerében

Zákány Florina¹, Székelyhidi Virág¹, Panyi György¹, Kovács Tamás¹

¹ Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

Számos makrofág funkcióban (citokin szekréció, migráció, fagocitózis, NO szintézis) felvetették ioncsatornák (így a Kv1.3, BK, KCa3.1, Hv1 vagy TRPM2) funkcionális szerepét, illetve ismert, hogy a sejtmembránban található lipidek befolyásolják az ioncsatornák működését. Így feltételezhető, hogy az elsősorban a makrofágok kóros működésével, valamint a lizoszomális béta-glükocerebrozidáz enzim deficienciája révén a glikozilceramid felhalmozódásával jellemezhető Gaucher-kórban az ioncsatornák eltérései jelentősek lehetnek a betegség patomechanizmusában, amelyet korábban még nem vizsgáltak. Ezért célunk egy olyan modell kialakítása, amellyel a későbbiekben vizsgálni tudjuk, hogy Gaucher-kórban milyen, ioncsatornákkal összefüggésbe hozható makrofág funkciók sérülnek.

Modellünk kialakítása során THP-1 monocitákat, belőlük differenciáltatott M0, illetve klasszikus (M1), alternatív (M2a) és regulatórikus (M2r) útvonalakon aktivált makrofágokat kezeltünk a betegségben deficiens enzim irreverzibilis gátlószerével, konduritol-B-epoxiddal (CBE), amelynek hatására a szubsztrát glükozilceramid felhalmozódása figyelhető meg előbb a lizoszómák, majd egyéb intracelluláris organellumok membránjában, illetve a sejtmembránban. A különböző koncentrációkban alkalmazott CBE hatására kialakuló enzimgátlás mértékét kolorimetriás módszerrel határoztuk meg, majd áramlási citometria és megfelelő antitestek segítségével meghatároztuk a CBE kezelés hatására a sejtmembrán ceramid és glükozilceramid tartalmában bekövetkező eltérések nagyságát, validálva modellrendszerünket a későbbi funkcionális mérések számára. Differenciációs és aktivációs protokolljaink áramlási citometriával történő tesztelése és optimalizálása után megvizsgáltuk különböző ioncsatorna gátlószerek (TEA, Vm24, paxilline, TRAM-34, ClGBI és flufenamát sav) hatását az eltérő útvonalakon aktivált makrofágok életképességére. Kísérleteinket a fenti ioncsatornák szerepének vizsgálatával folytatjuk különféle makrofág funkciók esetén.

Köszönetnyilvánítás

ÚNKP-18-3-IV-DE 54

Zákány Florina
Membránszterolok és -ceramidok támadáspontjának meghatározása feszültségkapuzott káliumcsatornákon voltage-clamp fluorometry (TEVCF) módszerrel

Aug 27 - kedd

16:45 – 17:00

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E22

Membránszterolok és -ceramidok támadáspontjának meghatározása feszültségkapuzott káliumcsatornákon voltage-clamp fluorometry (TEVCF) módszerrel

Zákány Florina¹, Kovács Tamás¹, Panyi György¹, Varga Zoltán¹

¹ Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A feszültségkapuzott káliumcsatornák (Kv) egy feszültségszenzor (VSD) és egy pórusdoménből (PD) épülnek fel. A VSD felelős a membránpotenciál érzékeléséért, míg a PD az ionok számára átjárható pórust alakítja ki. Ismert, hogy a membrán koleszterin (hiperkoleszetrinémia, Smith-Lemli-Opitz szindróma), illetve ceramid (Gaucher-kór) tartalmának növelése befolyásolja a Kv csatornák több kapuzási paraméterét. A kísérletek során azt határoztuk meg, hogy ezek a lipidek melyik doménen keresztül hatva fejtik ki elektrofiziológiai hatásaikat, a VSD vagy a PD az elsődleges célpontjuk.

A fenti betegségek membránbiofizikai modelljeinek kialakításához Xenopus laevis oociták membránját töltöttünk metil-béta-ciklodextrin-koleszterin vagy -7-dehidrokoleszterin komplexekkel, valamint C16-ceramiddal, illetve C16-glikozilceramiddal. Az elektrofiziológiai méréseket TEVCF módszerrel végeztük, ami a patch-clamp mérésekkel szemben az ionáramok meghatározásával egyidőben lehetővé teszi a VSD mozgásának monitorozását a VSD extracelluláris részének MTS-TAMRA fluoreszcens festékkel történő jelölését követően. Így egyszerre kapunk információt a PD (G-V görbe, áramkinetika) és a VSD (F-V görbe, fluor. jel kinetika) állapotáról a kapuzási folyamat alatt, ezáltal nemcsak a fent említett lipidek ionáramra gyakorolt elektrofiziológiai hatásai, hanem azok ioncsatornán belüli célpontja (VSD vagy PD) is azonosíthatóvá válnak. A VSD-PD közti csatolás vizsgálatoz az eltérő csatolási mechanizmussal bíró Kv1.3 és Kv10.1 csatornákon végeztük el a kísérleteinket.

Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a szterolok elektrofiziológiai hatásaikat a Kv csatornák PD-jén keresztül fejtik ki. Ezzel szemben a C16-glikozilceramid és C16-ceramid más támadásponttal rendelkezik, méréseink alapján előbbi a PD-n, utóbbi a VSD-n keresztül fejti ki hatását. A ceramidok támadáspontjának további vizsgálatához a két VSD-ből felépülő feszültségkapuzott protoncsatornán (Hv1) tervezünk hasonló méréseket.

Köszönetnyilvánítás: ÚNKP-18-3-IV-DE 54