Összes szerző

Nagy Péter

az alábbi absztraktok szerzői között szerepel:

Batta Gyula
A Gaucher betegség in vitro modell sejtjeinek megnövekedett számú nanocső és extracelluláris vezikulum képzése

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P18

A Gaucher betegség in vitro modell sejtjeinek megnövekedett számú nanocső és extracelluláris vezikulum képzése

Batta Gyula1,2; Malta Neri Lara Chrystina2; Visnovitz Tamás3; Visnovitzné Vukman Krisztina3; Buzás Edit3, Nagy Péter2

1Debreceni Egyetem, Természettudományi és Technológiai Kar, Genetikai és Alkalmazott Mikrobiológiai Tanszék

2Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

3Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet

Az örökletes Gaucher betegség egy olyan lizoszómális tárolási betegség, amelyben glikozilceramid és egyéb szfingolipidek felhalmozódnak a sejtekben, ami a glükocerebrozidáz enzim hibás működésének köszönhető. A betegség különböző megjelenési formákat mutat, melyek súlyossága tág határok között mozog. Bizonyos esetekben a diagnózis csak felnőtt korban történik meg, míg más típusai korai elhalálozáshoz vezetnek. A betegség során fellépő tüneteket klasszikusan elsősorban a megemésztetlen szubsztrátok lizoszómális felhalmozódásának tulajdonítják, ugyanakkor korábban sikerült bebizonyítanunk, hogy a plazmamembrán számos biofizikai és sejtbiológiai tulajdonsága is megváltozik, ami szintén hozzájárulhat a betegség tüneteinek kialakulásához.

A vizsgálatokhoz fluoreszcens mikroszkópot és „Tunable Resistive Pulse Sensing” (TRPS) mérésére alkalmas műszert alkalmaztunk. A Gaucher betegséget modellező makrofágok THP-1, illetve U937 monocita sejtvonalból származtak, melyekben a glükocerebrozidáz enzim működését CBE-vel (conduritol B epoxide) gátoltuk, és a differenciáltatást PMA-val (phorbol 12-myristate 13-acetate) indukáltuk.

A szfingolipidekben gazdag membránokban a raftszerűen rendezett membrándomének megnövekedése tapasztalható, ami a TNT-k („tunneling nanotube”) képzésének emelkedésével járt. Továbbá, méréseink alapján sikerült azt is kimutatni, hogy az extracelluláris vezikulumok (EV) képzése is megemelkedik a Gaucher modell makrofágok tenyésztése során. Ezeket az eredményeinket összevetve a korábbi eredményeinkkel, azt az előzetes következtetést vonhatjuk le, hogy a megnövekedett szfingolipid mennyiség a pozitív görbület kialakításának irányába tereli membránt (TNT és EV képzés), viszont ez magával vonzza az endocitózis csökkent hatékonyságát is.

Cs. Szabó Bence
A sejtmembrán szterol tartalmának változtatása módosítja a Kv1.3 ioncsatorna lipidtutajok és egyéb membrán mikrodomének közötti megoszlását

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

II. Poszterszekció

P47

A sejtmembrán szterol tartalmának változtatása módosítja a Kv1.3 ioncsatorna lipidtutajok és egyéb membrán mikrodomének közötti megoszlását

Cs. Szabó Bence, Szabó Máté, Zákány Florina, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás

Debreceni Egyetem ÁOK Biofizikai és Sejtbiológia Intézet

A limfociták aktivációjában szerepet játszó Kv1.3 ioncsatornáról ismert, hogy preferenciálisan a lipidtutajokban helyezkedik el. A lipidtutajokban található jelátviteli környezet szerepet tölthet be az ioncsatorna működésének szabályozásában. Munkacsoportunkban korábban kimutatták, hogy a membrán szterol tartalmának szelektív növelése megváltoztatja a Kv1.3 elektrofiziológiai jellemzőit. A töltések során bevitt szterolok és a csatorna kölcsönhatásának pontos mechanizmusa azonban nem ismert.

Célunk volt a membrán szterol tartalmának szelektív manipulálása után a Kv1.3 és a lipidtutajok közötti kolokalizáció vizsgálata. Ehhez HEK-293 sejtekben a koleszterin vagy 7-dehidrokoleszterin (7DHC) mennyiségét növeltük a megfelelő szterol/metil-béta-ciklodextrin (MBCD) komplexekkel, illetve koleszterint vontunk ki a sejtek membránjából MBCD alkalmazásával. Ezután jelöltük a sejtekbe transzfektált Kv1.3-FLAG csatornákat anti-FLAG antitesttel és a lipidtutajokat koleratoxin B alegységével, majd konfokális, illetve stimulált emisszió kioltás (STED) mikroszkóp segítségével felvételeket készítettünk. Kvantitatív képanalízis során meghatároztuk a Kv1.3, illetve tutaj jelölők intenzitásai közötti Pearson-féle korrelációs koefficiens értékét.

Méréseink alapján a kontrollhoz (0,416±0,013, n=27) képest a membrán koleszterin, illetve 7DHC tartalma növelésének hatására a Kv1.3 tutajokkal történő kolokalizációja szignifikánsan (p<0,05) növekedett (koleszterin esetén 0,492±0,013, n=34; 7DHC mellett 0,500±0,015, n=32), míg MBCD kezelés után szignifikánsan csökkent (0,338±0,014, n=30). Konfokális mikroszkópos eredményeinket a nagyobb feloldóképességgel bíró STED mikroszkópiával is megerősítettük (kontroll: 0,274±0,025, n=25; koleszterin: 0,361±0,019, n=32; 7DHC: 0,366±0,019, n=28; MBCD: 0,219±0,022, n=24).

Kísérleteink során kimutattuk, hogy a Kv1.3 membrán mikrodomének közötti megoszlása függ a sejtmembrán szterol tartalmától, ami mediálhatja a szterolok ioncsatornákra kifejtett hatásait.

Kovács Tamás
A dipólpotenciál mérése membránösszetétel-változással járó betegségek membránbiofizikai modellrendszereiben új áramlási citométeres módszerrel

Aug 27 - kedd

09:55 – 10:10

Sejtanalitika biofizikai megközelítéssel

E7

A dipólpotenciál mérése membránösszetétel-változással járó betegségek membránbiofizikai modellrendszereiben új áramlási citométeres módszerrel

Szabó Máté, Zákány Florina, Cs. Szabó Bence, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás1

1 Debreceni Egyetem Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A membrán dipólpotenciálja (DP) a lipidekhez asszociált interfaciális vízmolekulák, illetve a foszfolipidek és szterolok dipoláris szegmentumainak rendezett térbeli orientációjából ered. A dipólok elrendeződése révén ≈300 mV-os pozitív potenciál jön létre, amely a transzmembrán és felületi potenciáloknál jóval nagyobb intramembrán elektromos erőteret eredményez, befolyásolva a membránfehérjék konformációját és funkcióit. A DP nagyságát főleg a membrán lipidösszetétele, különösen a szterolok mennyisége határozza meg. Elhelyezkedése miatt mérése rendkívül nehéz, erre főleg a feszültségszenzitív di-8-ANEPPS fluorofórt használják spektrofluoriméteres vagy konfokális mikroszkópos excitációs arányméréses assay során. Ezen módszerek azonban jelentős hátrányokkal rendelkeznek, így célul tűztük ki egy új DP mérési módszer kifejlesztését.

Kísérleteink során egy újonnan leírt 3-hidroxiflavon-származék használatával kidolgoztunk és optimalizáltunk egy áramlási citometriás technikát a DP mérésére. Alkalmazásának alapja, hogy excitáció után a fluorofórban gerjesztett állapotú intramolekuláris proton transzfer reakció megy végbe. Az így kialakuló normál és tautomer forma emissziója elkülönül és mivel a két forma relatív előfordulása az intramembrán elektromos erőtér függvénye, a flurofór alkalmas a DP meghatározására emissziós arányméréses assay segítségével.

Ismert DP-t módosító kezelések (phloretin, 6-ketocholestanol) használatával bizonyítottuk módszerünk alkalmazhatóságát, di-8-ANEPPS-sel végzett spektrofluorimetriás referenciamérések mellett. JY lymphoblastoid és THP-1 monocita sejtekben kimutattuk, hogy a membrán koleszterin, illetve 7-dehidro-koleszterin tartalmának metil-β-ciklodextrin/szterol komplexekkel történő növelése dózisfüggő módon növeli a DP nagyságát.

A munkánk során optimalizált új áramlási citometriás módszer alkalmazható nagy mennyiségű élő sejt DP-jának gyors, egyszerű és megbízható mérésére.

Nizsalóczki Enikő
Az IL-9R és IL-2R térbeli kapcsolatának kvantitatív analízise humán T limfóma sejteken

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P22

Az IL-9R és IL-2R térbeli kapcsolatának kvantitatív analízise humán T limfóma sejteken

Nizsalóczki Enikő1, Nagy Péter1, Mocsár Gábor1, Szabó Ágnes1, Csomós István1, Thomas A. Waldmann2, Vámosi György1, Mátyus László1, Bodnár Andrea1

1 DE ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Lymphoid Malignancies Branch, National Institutes of Health, Bethesda, USA

Az interleukin-9 (IL-9) egy multifunkcionális citokin, amelynek a T sejtek onkogenezisében betöltött szerepére egyre több adat utal. A heterodimer IL-9R komplexet a citokin-specifikus α-lánc és a közös γc alegység alkotja. Ez utóbbi alegység más citokinreceptorok, így a T sejt funkció szabályozásában központi szerepet betöltő IL-2R felépítésében is részt vesz. Konfokális mikroszkópiás képek Pearson-féle korrelációs analízisével korábban feltártuk az IL-9R és IL-2R kettős térbeli viszonyát humán T limfóma sejteken: míg a sejtek egy részében a két receptorfajta közös klaszterek kialakításában vesz részt, más sejtekre szegregált membrándoménekben történő elhelyezkedésük a jellemző. Jelen vizsgálatainkban tovább elemeztük a két receptorfajta térbeli kapcsolatát a Kit225/IL-9R humán T limfóma sejtvonalon. A konfokális mikroszkópiás képek elemzése során a Pearson-féle korrelációs együttható meghatározását kiegészítettük a Manders-féle co-occurance (együttes előfordulás) analízissel. Kimutattuk, hogy az IL-9 és IL-2 receptorok egy minimális, ám a véletlen által generálttól szignifikánsan magasabb hányadának ko-lokalizációja az összességében negatív korrelációt mutató (a két receptorfajtát döntően elkülönülő membránterületeken kifejező) sejteken is megfigyelhető. FRET kísérleteink igazolták az IL-9/IL-2R rendszer elemeinek molekuláris szintű (1-10 nm) közelségét, azaz az alegységek közös klasztereinek jelenlétét. IL-9 kötődés hatására a FRET hatásfokok módosultak, ami az IL-9/IL-2R rendszer elemeinek konformáció változására és/vagy a receptor alegységek térbeli átrendeződésére utalhat. Hipotézisünk szerint az IL-9R és IL-2R általánosan előforduló klaszterei az IL-9/IL-9R jelátvitelhez szükséges „hot spot”-ként szolgálhatnak, amely elősegíti a közös receptor alegységek és jelátviteli molekulák optimális felhasználását és a megfelelő receptor komplexek összeszerelődését.

Szabó Máté
Szterolok és többszörösen telítetlen zsírsavak dipólpotenciálra gyakorolt hatásának vizsgálata új áramlási citometriás módszerrel

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P2

Szterolok és többszörösen telítetlen zsírsavak dipólpotenciálra gyakorolt hatásának vizsgálata új áramlási citometriás módszerrel

Szabó Máté, Zákány Florina, Cs. Szabó Bence, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás1

1DE ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A dipólpotenciál (DP) +300 mV-os intramembrán potenciál, amely jelentősen befolyásolja a transzmembrán fehérjék konformációját és funkcióit. A membrán szterol tartalmának emelése növeli a DP nagyságát, így hiperkoleszterinémiában (HC), illetve Smith-Lemli-Opitz szindrómában (SLOS), ahol a membrán koleszterin, illetve 7-dehidrokoleszterin (7DHC) tartalma emelkedik, várható a DP patofiziológiai jelentőséggel bíró növekedése. A DP mérésére a legelterjedtebb módszer a di-8-ANEPPS fluorofórt alkalmazó spektrofluoriméteres vagy mikroszkópos excitációs aránymérés, melynek alkalmazhatósága azonban erőteljesen korlátozott, így célunk volt egy hatékony DP mérési módszer fejlesztése és tesztelése a fenti betegségek membránbiofizikai modelljeiben.

Munkánk során kidolgoztunk egy F66 feszültségszenzitív fluorofórt alkalmazó, emissziós aránymérésen (Rem) alapuló áramlási citométeres technikát a DP mérésére, összevetve eredményeinket spektrofluorimetriás referenciaméréseink adataival. Ismert DP-t módosító kezelések (phloretin, 6-ketocholestanol) használatával bizonyítottuk módszerünk alkalmazhatóságát, az F66 Rem negatív korrelációt mutatott a DP nagyságával (szenzitivitás: kb. -15%/100 mV). Ezután JY és THP-1 sejtvonalakon és humán PBMC-ken létrehoztuk a fenti betegségek modelljeit és meghatároztuk a DP nagyságát új módszerünkkel.

A HC, illetve SLOS modelljében kimutattuk, hogy a membrán koleszterin, illetve 7DHC tartalmának növelése a megfelelő metil-béta-ciklodextrin/szterol komplexekkel dózisfüggő módon növelte a DP nagyságát (∆Rem,max -14%, illetve -8%). A HC terápiájában kiegészítésként használt magas telítetlen zsírsav tartalmú diéta hatásának vizsgálata során omega-3 zsírsav alkalmazása dózisfüggően csökkentette, míg omega-6 zsírsav növelte a DP-t (∆Rem,max +10%, illetve -5%).

Új áramlási citometriás módszerünk alkalmazható nagyszámú élő sejt DP-jának gyors, egyszerű és megbízható mérésére és a sejtmembrán összetételének megváltozásával járó betegségek vizsgálatára.

Szendi-Szatmári Tímea
A fluorofór szaturáció hátrányos hatásának csökkentése FRET mikroszkópos mérések során

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P25

A fluorofór szaturáció hátrányos hatásának csökkentése FRET mikroszkópos mérések során

Szendi-Szatmári Tímea1, Szabó Ágnes1,2, Szöllősi János1,2, Nagy Péter1

1Debreceni Egyetem Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2MTA-DE Sejtbiológiai és Jelátviteli kutatócsoport

A Förster rezonancia energia transzfer a világon széles körben elterjedt, és alkalmazott biofizikai mérő módszer. Méréseink során vizsgáltuk a fluorofór szaturáció hatását az intenzitás alapon számolt FRET hatékonyságra. Konfokális mikroszkópiában a magas numerikus apertúrájú objektív fókuszpontjában a gerjesztő fény intenzitása olyan magas, hogy a fluorofórok fluoreszcenciája szaturálódik. Tehát levonható az a következtetés, hogy az emittált fény intenzitása nem nő egyenesen arányosan a gerjesztő fény intenzitásával. Ez a jelenség megkérdőjelezi a kvantitatív fluoreszcenciás vizsgálatok pontosságát, illetve a FRET hatékonyság félrebecsléséhez vezethet. Azért, hogy bizonyítsuk a szaturáció hatását, sejteket jelöltünk olyan antitestekkel, amik az ErbB2 sejtfelszíni fehérje két különböző epitópjára specifikusak. A jelölést követően a különböző lézerintenzitások mellett felvett mikroszkópos képeken hetero-FRET értékeket számoltunk. Az eredményeink azt mutatták, hogy a FRET értékek csökkentek a donor gerjesztő lézer növekvő intenzitásainak függvényében. Munkánk során bemutatunk egy olyan módszert, ami megszünteti a FRET hatékonyság magas gerjesztő fénytől való függését, és hozzájárul a fehérje-fehérje kölcsönhatások megbízható és műszerfüggetlen vizsgálatához.


Zákány Florina
Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P30

Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

Zákány Florina1, Kovács Tamás1, Sohajda Tamás2, Szente Lajos2, Nagy Péter1, Panyi György1, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 CycloLab Cyclodextrin R & D Laboratory Ltd., Budapest

A ciklodextrinek (CD) hat (αCD), hét (βCD), illetve nyolc (γCD) alfa-D-glükopiranóz-egységből álló ciklikus oligoszacharidok. Alakjuk belül üreges, hidrofób csonkakúp, így képesek gyógyszermolekulákkal és különböző lipidekkel komplexeket képezni. Széles körben alkalmazzák őket gyógyszerekben semleges vivőanyagként, illetve a kutatásban a membrán koleszterintartalmának szelektív csökkentésére (metil-β-ciklodextrin; MβCD). A ciklodextrinek ioncsatornákra kifejtett direkt hatásait korábban nem vizsgálták. Mivel a feszültégkapuzott káliumcsatornák (Kv) számos biológiai folyamatot kontrollálnak, a CD-ek ezen csatornákra gyakorolt direkt hatásaik révén szerepet játszhatnak számos gyógyszer ismert mellékhatásainak kialakításában (pl.immunszupresszió).

Célunk az MβCD, valamint három különböző inverz (hat, hét vagy nyolc 3,6,-anhidroglükózból álló, belül hidrofil, kívül hidrofób) ciklodextrin (iαCD; iβCD; iγCD) direkt ligand hatásainak karakterizálása Kv1.3-on, illetve annak alátámasztása, hogy ez a ligand hatás független a CD-ek koleszterin depletáló és/vagy membránbiofizikai paramétereket módosító képességétől.

A direkt hatások vizsgálatához a patch-clamp méréseket Kv1.3 ioncsatornával es EGFP-vel kotranszfektált CHO sejteken végeztük. A CD-ek 1 és 5 mM-os koncentrációban részben reverzibilsen gátolták a Kv1.3 ionáramot (MβCD< iαCD< iγCD), kivéve az iβCD, aminek nem volt ilyen hatása. A membránbiofizikai mérések során 1 órás inkubációt követően megvizsgáltuk a CD-k hatását a membrán fluiditásra, hidrációra, rendezettségre, illetve kolorimetriásan meghatároztuk a koleszterin kivonás abszolút mértékét. A CD-k közül egyedül az MβCD-nek volt koleszterin depletáló és membránfizikai hatása, az iCD-knek nem.

Ezek alapján elmondható, hogy a CD-knek a membrán koleszterintartalom módosításától független, eddig le nem írt direkt gátló hatással is bírnak a Kv ioncsatornákra, amelynek fontos szerepe lehet a belőlük készült gyógyszerek mellékhatásainak kialakításában.