Összes szerző

Mocsár Gábor

az alábbi absztraktok szerzői között szerepel:

Mocsár Gábor
Fehérjeklaszterek T sejtek membránjában és blebjein

Aug 27 - kedd

16:15 – 16:30

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E20

Fehérjeklaszterek T sejtek membránjában és blebjein

Mocsár Gábor¹, Zubánics-Nagy Áron¹, Volkó Julianna¹, Tóth Katalin², Waldmann Thomas A. ⁴, Wieser Stefan³, Vereb György¹, Schütz Gerhard³, Bodnár Andrea¹, Vámosi György¹

¹ Debreceni Egyetem, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

²German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany

³Institute of Applied Physics, Vienna University of Technology

⁴Lymphoid Malignancies Branch, National Cancer Institute, Bethesda, USA

A membránfehérjékből felépülő sejtfelszíni struktúrák változatos térbeli és időbeli szerkezettel rendelkeznek, több hierarchikus szinten szerveződnek. Az immunfolyamatokban fontos szereppel rendelkező interleukin-2 és -15 citokin receptorok és az MHC I és II molekulák közös klaszterekben fejeződnek ki T sejtek membránjában. Tápanyag megvonás hatására a sejteken apoptotikus/nekrotikus membrán hólyagok, blebek alakulnak ki, a nagyméretű blebek membránja nem rendelkezik citoszkeletális kapcsolatokkal, azokat citoszkeleton mentes modellmembránnak használtuk.

Kísérleteinkben arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a citoszkeleton hiánya, a fehérjék mobilitásának a növekedése, illetve a membrán mikrodomén szerkezetének megváltozása a blebeken hogyan hat az MHC I, MHC II, valamint az IL-2Rα és IL-15Rα- alegységek klaszterméreteire, homo- illetve heteroasszociációjára, a fehérje-fehérje kölcsönhatások stabilak maradnak-e a citoszkeleton hiányában.

Az ép sejtfelszínen, illetve a blebek felszínén a receptorok és molekulák klaszterméreteinek meghatározását szuperfeloldású STED képek analízisével végeztük el. A közös komplexekben levő fehérjék arányát fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópiával vizsgáltuk meg. A fehérjék homo- és heteroasszociációit többcsatornás fluoreszcencia intenzitásmérésen alapuló mikroszkópos FRET méréssel jellemeztük.

Méréseink szerint, 40 nm-es feloldás mellett, a blebek felszínén fehérjeeloszlások homogének, nem volt jele magasabb szintű szerveződésnek, illetve mikrodomének jelenlétének. A mérési eredmények alapján megállapítható, hogy a fehérjék aránya a közös komplexekben, valamint ezen fehérjeasszociációk stabilitása független a citoszkeletonnal való kapcsolattól és a magasabb szerveződésű sejtmembrán eltűnésétől.

Nizsalóczki Enikő
Az IL-9R és IL-2R térbeli kapcsolatának kvantitatív analízise humán T limfóma sejteken

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P22

Az IL-9R és IL-2R térbeli kapcsolatának kvantitatív analízise humán T limfóma sejteken

Nizsalóczki Enikő¹, Nagy Péter¹, Mocsár Gábor¹, Szabó Ágnes¹, Csomós István¹, Thomas A. Waldmann², Vámosi György¹, Mátyus László¹, Bodnár Andrea¹

¹ DE ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² Lymphoid Malignancies Branch, National Institutes of Health, Bethesda, USA

Az interleukin-9 (IL-9) egy multifunkcionális citokin, amelynek a T sejtek onkogenezisében betöltött szerepére egyre több adat utal. A heterodimer IL-9R komplexet a citokin-specifikus α-lánc és a közös γc alegység alkotja. Ez utóbbi alegység más citokinreceptorok, így a T sejt funkció szabályozásában központi szerepet betöltő IL-2R felépítésében is részt vesz. Konfokális mikroszkópiás képek Pearson-féle korrelációs analízisével korábban feltártuk az IL-9R és IL-2R kettős térbeli viszonyát humán T limfóma sejteken: míg a sejtek egy részében a két receptorfajta közös klaszterek kialakításában vesz részt, más sejtekre szegregált membrándoménekben történő elhelyezkedésük a jellemző. Jelen vizsgálatainkban tovább elemeztük a két receptorfajta térbeli kapcsolatát a Kit225/IL-9R humán T limfóma sejtvonalon. A konfokális mikroszkópiás képek elemzése során a Pearson-féle korrelációs együttható meghatározását kiegészítettük a Manders-féle co-occurance (együttes előfordulás) analízissel. Kimutattuk, hogy az IL-9 és IL-2 receptorok egy minimális, ám a véletlen által generálttól szignifikánsan magasabb hányadának ko-lokalizációja az összességében negatív korrelációt mutató (a két receptorfajtát döntően elkülönülő membránterületeken kifejező) sejteken is megfigyelhető. FRET kísérleteink igazolták az IL-9/IL-2R rendszer elemeinek molekuláris szintű (1-10 nm) közelségét, azaz az alegységek közös klasztereinek jelenlétét. IL-9 kötődés hatására a FRET hatásfokok módosultak, ami az IL-9/IL-2R rendszer elemeinek konformáció változására és/vagy a receptor alegységek térbeli átrendeződésére utalhat. Hipotézisünk szerint az IL-9R és IL-2R általánosan előforduló klaszterei az IL-9/IL-9R jelátvitelhez szükséges „hot spot”-ként szolgálhatnak, amely elősegíti a közös receptor alegységek és jelátviteli molekulák optimális felhasználását és a megfelelő receptor komplexek összeszerelődését.

Rehó Bálint
Magreceptorok mobilitásának és dimerizációjának vizsgálata élő sejtekben SPIM-FCCS és FRET segítségével

Aug 27 - kedd

09:25 – 09:40

Sejtanalitika biofizikai megközelítéssel

E5

Magreceptorok mobilitásának és dimerizációjának vizsgálata élő sejtekben SPIM-FCCS és FRET segítségével

Rehó Bálint¹, Lukas Lau², Mocsár Gábor¹, Jan Wolfgang Krieger², Jörg Langowski², Tóth Katalin², Vámosi György¹

¹ Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² German Cancer Research Center, Biophysics of Macromolecules

A magreceptorok szupercsaládjába olyan fehérjék tartoznak, amelyek ligandfüggő módon képesek szabályozni célgénjeik átírását. Kutatásunk során a retinoid receptorok családjába tartozó reténsav receptor (RAR) és a retinoid X receptor (RXR) kölcsönhatásait vizsgáljuk élő sejtekben. Működésüket a molekuláris kapcsoló modell írja le. Ezek a receptorok ligand hiányában DNS-hez kapcsolódva korepresszor komplexet kötnek és gátolják célgénjeik átíródását. A modell szerint agonista ligand hatására (az A vitamin származékai) a receptorok konformációváltozáson mennek keresztül, melynek során koregulátor csere történik és a korepresszor komplex aktivátor komplexre cserélődik. Ezt a modellt a területen zajló intenzív kutatások eredményeképp egyre dinamikusabb kép kezdi felváltani.

Vizsgálataink során arra voltunk kíváncsiak, hogyan változik a magreceptorok mobilitása és egymáshoz való affinitásuk ligand jelenlétében és hiányában.

Kísérleteink során HeLa sejtekbe transzfektáltunk fluoreszcens proteinekkel (GFP, mCherry) jelölt magreceptorokat. A mobilitásban bekövetkező változásokat fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiával (FCS) követtük nyomon. Heidelbergi kollaborációs partnereinknél fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópiával (FCCS) kombinált Selective Plane Illumination Mikroszkópiai (SPIM) méréseket végeztünk⁽¹⁾. A sejtekről készült SPIM képeken FRET analízist is végrehajtottunk, hogy tovább növeljük méréseink információtartalmát.

Vizsgálataink kimutatták, hogy a receptorok mobilitása agonista ligand hatására csökken, valamint sikerült megmutatnunk azt is, hogy a két receptor kotranszfekciója ligand nélkül is a mobilitás csökkenéséhez vezet. Bebizonyítottuk továbbá, hogy egyes receptor-komplexek csak az egyik fél felől aktiválhatóak.⁽²⁾

SPIM-F(C)CS-el kombinált FRET vizsgálataink egy igen komplex rendszer képét kezdik kirajzolni, és segíthetnek feltárni a magreceptorok aktivációjában és dimerziációjában szerepet játszó molekuláris mechanizmusokat.

Köszönetnyilvánítás

GINOP-2.3.2-15-2016-00026, DAAD #273478

Irodalom

[1] Krieger, J. W., Singh, A. P., Bag, N., Garbe, C. S., Saunders, T. E., Langowski, J., & Wohland, T. (2015). Imaging fluorescence (cross-) correlation spectroscopy in live cells and organisms. Nature Protocols, 10(12), 1948-1974.

[2] Brazda, P., Krieger, J., Daniel, B., Jonas, D., Szekeres, T., Langowski, J., Vamosi, G. (2014). Ligand Binding Shifts Highly Mobile Retinoid X Receptor to the Chromatin-Bound State in a Coactivator-Dependent Manner, as Revealed by Single-Cell Imaging. Molecular and Cellular Biology, 34(7), 1234-1245.

Volkó Julianna
Új intracelluláris jelátviteli mechanizmus? Interleukin receptor összeszerelődés az ER-ben és a Golgi-ban

Aug 27 - kedd

16:30 – 16:45

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E21

Új intracelluláris jelátviteli mechanizmus? Interleukin receptor összeszerelődés az ER-ben és a Golgi-ban

Volkó Julianna¹, Kenesei Ádám¹, Mocsár Gábor¹, Várnai Péter², Tóth Katalin³, Waldmann Thomas A.⁴, Vámosi György¹

¹ Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² Semmelweis Egyetem, ÁOK, Élettani Intézet

³German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany

⁴NIH, CCR, Lymphoid Malignancies Branch, Bethesda MD, USA

Az interleukin-2 és -15 citokinek központi szerepet töltenek be az immunrendszer szabályozásában, kontrollálva a limfociták túlélését és apoptózisát, meghatározó jelentőségűek különböző leukémiákban és autoimmun betegségekben. Heterotrimer receptoraik a sejtmembránban ligandspecifikus, saját α-alegységekkel rendelkeznek, ugyanakkor a jelátvivő β- és γc-láncokat közösen használják. A sejtfelszínen kifejeződő receptor láncokat célzó anti-IL-2Rα (daclizumab) terápiákkal, melyek a T sejt proliferáció gátlására irányulnak, csekély siker érhető el felnőttkori T sejtes leukémiában (ATL) és sclerosis multiplex-ben. Kiváncsiak voltunk, vajon az IL-2R alegységek képesek-e összeszerelődni így hatékony jelátvitelt lehetővé tenni már az endoplazmatikus retikulumban (ER) és/vagy a Golgi-ban, mielőtt a sejtfelszínre jutnak.

Az EGFP vagy mCherry fluoreszcens fehérjével jelölt receptor láncok összeszerelődését a szekréciós úton (az ER és a Golgi területén) élő HeLa sejtekben vizsgáltuk konfokális mikroszkópiás intenzitás-alapú Förster rezonancia energia transzfer (FRET) mérések segítségével.

Az ER-ben és a Golgi-ban is sikerült energiatranszfert mérni a β- és a γc-, valamint a β- és az IL-2Rα- ill. IL-15Rα alegységek között. Az IL-2Rα heteroasszociációját az IL-15Rα-val és a γc-láncok homoasszociációját szintén kimutattuk ezekben a sejtorganellumokban. A β-IL-2Rα/IL-15Rα és az IL-2Rα-IL-15Rα heteroasszociációkat jellemző energiatranszfer hatásfokok szignifikánsan magasabbak voltak a plazmamembránban, mint az ER-ben vagy a Golgi-ban, ami arra utal, hogy a szekréciós út során történő részleges asszociáció után, az alegységek összeszerelődése a sejtfelszínen fejeződik be.

IL-2-termelő T sejtekben a jelátvitel végbemehet az ER/Golgi-ban előre összeszerelődött receptorok által. Eredményeink rávilágíthatnak az intracelluláris autokrin jelátvitel egy új paradigmájára ill. magyarázatot adhatnak a sejtfelszíni receptorokat célzó antagonista antitest terápiák rezisztenciájára.