Összes szerző

Mihály Judith

az alábbi absztraktok szerzői között szerepel:

Antal Lilla
Humán plazma eredetű extracelluláris vezikulák izolálási módszereinek összehasonlítása

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

II. Poszterszekció

P54

Humán plazma eredetű extracelluláris vezikulák izolálási módszereinek összehasonlítása 

Antal Lilla1, Balázs Katalin1, Kis Dávid1, Mihály Judith2, Persa Eszter1, Sándor Nikolett1, Szatmári Tünde1, Lumniczky Katalin1

1 Nemzeti Népegészségügyi Központ, Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Főosztály, Sugárorvostani osztály

2Magyar Tudományos Akadémia, Természettudományi Kutatóközpont, Anyag és Környezetkémiai Intézet, Biológiai Nanokémia Kutatócsoport

Az extracelluláris vezikulák sejtekből származó, membránnal körülvett struktúrák. Termelődésük legalább olyan általános sejtbiológiai jelenség, mint a sejtosztódás, a sejtmozgás vagy a programozott sejthalál. Működésük lehetővé teszi a fehérjék, RNS-ek, sőt DNS-ek sejtek közötti kicserélődését. Extracelluláris vezikulákat mind az egészséges, mind a daganatos sejtek termelnek. A tumoros sejtek által termelt extracelluláris vezikulák mennyiségét és a bennük szállított mikro-RNS profilját vizsgálva a normális sejttől eltérő mikro-RNS-profilt találtak. A megnövekedett mennyiségű extracelluláris vezikula által lehetőség nyílik a tumorasszociált jelátviteli molekulák és mikro-RNS-ek célsejthez való eljutásának vizsgálatára, ami a daganatos állapotok progressziójában is valószínűsíti jelentőségüket. Az extracelluláris vezikulák vérplazmában mért mennyisége, a terápia során megfigyelt minőségi változása miatt felmerült, hogy a diagnosztikában, prognosztikában, illetve a minimális reziduális betegség monitorozásában is használhatók lehetnek.

Kutatásom célja humán prosztatarákos betegek fagyasztott plazmájából származó extracelluláris vezikulák felszíni markereinek és beltartalmának vizsgálata, azon belül mikro-RNS tartalmának jellemzése. Az említett vizsgálatokhoz megfelelő tisztaságú és mennyiségű izolált extracelluláris vezikula mintákra van szükségem. Ennek érdekében jelen tanulmányban négy különböző, a tudományos világban gyakran használt izolálási módszert hasonlítok össze: ultracentrifugálás, IZON qEV, ExoQuick ULTRA és PLUS. A módszerek összehasonlításához használt kontroll minta egészséges fagyasztott humán plazma volt. A kiválasztott módszerekkel izolált extracelluláris vezikulákat tisztaságuk, méretük és mennyiségük alapján jellemeztem. A kapott eredmények összehasonlítása alapján kiválasztottam a további vizsgálataimhoz legmegfelelőbb technikát.

Ez a munka az EU által finanszírozott CONCERT (662287) és az NKFIH által finanszírozott OTKA (124879) projektek támogatásával valósult meg.

Kitka Diána
Extracelluláris vezikula koncentráció meghatározása humán vérplazmában és szérumban on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfiával és mikrofluidikus ellenállás impulzus méréssel

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

II. Poszterszekció

P49

Extracelluláris vezikula koncentráció meghatározása humán vérplazmában és szérumban on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfiával és mikrofluidikus ellenállás impulzus méréssel

Kitka Diána1, Mihály Judith1, Varga Zoltán1

1 Magyar Tudományos Akadémia Természettudományi Kutatóközpont, Anyag-és Környezetkémiai Intézet

Az élő sejtek közötti kommunikáció egyik újonnan felfedezett útvonala az ún. extracelluláris vezikulákon (EVken) keresztüli információcsere, amely az elmúlt évtizedben a kutatások középpontjába került. Az EVk olyan, a sejten kívüli térben található, kettős foszfolipid membránnal határolt, sejt eredetű (nano)struktúrák, amelyek számos információt hordoznak a kibocsátó sejt állapotáról. Az EVk mennyisége és fajtái nagyban függnek az adott egyén fiziológiás és patológiás állapotától, így betegségek korai EV-alapú diagnosztizálása is lehetségessé válhat. A vér az egyik legnagyobb intermedier közeg és egyben a legfontosabb biomarker forrás, ugyanakkor EVk izolálása, detektálása és jellemzése ebből a komplex mátrixból számos nehézségbe ütközik.

Munkánk célja humán vérből izolált EVk meghatározása és jellemzése olyan újszerű technikákkal, mint az on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfia (Flu-SEC) és a mikrofluidikus ellenállás impulzus mérés (MRPS).

A kísérletekhez egészséges önkéntesektől gyűjtöttünk vért szérum (szérum aktivárok) és plazma (K3EDTA, ACD-A) vérvételi csövekbe. A sejtes elemek eltávolítása két centrifugálási lépéssel történt (2x 2500 x g), majd az EVket méretkizárásos kromatográfiával izoláltuk. Az nCS1 MRPS készülékkel (Spectradyne LLC, USA) történő részecskeszám meghatározás a 65 nm – 250 nm és 250 nm – 2000 nm közötti mérettartományban történt. A Flu-SEC mérések egy FP-2020 fluoreszcenciás detektorral összekapcsolt HPLC rendszerrel (Jasco, Japan) történtek egy 4 mL CL-2B géllel töltött méretkizárásos oszlop használatával. A EV minták fluoreszcens jelöléséhez PE-CD61, PE-CD81 és AF488-CD41 antitesteket használtunk.

Az MRPS mérések alapján a szérumban jelentősen magasabb EV koncentráció volt tapasztalható (1010 illetve 7x107 részecske/mL) mint a plazmában (4-6x109 illetve 1-2x107 részecske/mL). A két technika kombinációjával a vérlemezke és az extracelluláris vezikula specifikus fluoreszcens antitestekkel jelölt EVk mértékét is meg tudtuk határozni.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást az NKFIH PD 121326 és NVKP_16-1-2016-0007 pályázatok anyagi támogatásával végeztük. V.Z. munkáját a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj támogatta.

Mihály Judith
Extracelluláris vezikulák IR spektroszkópiája

Aug 27 - kedd

15:20 – 15:40

Membránok és membránfehérjék biofizikája

E17

Extracelluláris vezikulák IR spektroszkópiája

Mihály Judith, Bebesi Tímea, Kitka Diána, Szentirmai Veronika, Szigyártó Imola Csilla, Bóta Attila, Varga Zoltán

MTA Természettudományi Kutatóközpont, Anyag- és Környezetkémiai Intézet

Az extracelluláris vezikulák (EV-k) az utóbbi években kerültek a tudományos érdeklődés középpontjába: ismertté vált, hogy a sejtek foszfolipid kettősréteggel határolt nanoméretű struktúrákat, ún. extracelluláris vezikulákat bocsájtanak ki, amelyek jelentős szerepet játszanak a sejtek közötti intercelluláris kommunikációban. Bár az EVk kiemelkedő lehetőséggel bírnak, mint betegségmarkerek vagy gyógyszerhordozók, klinikai alkalmazásukhoz szükség van a megfelelő észlelési és jellemzési módszerek kidolgozására. Az infravörös (IR) spektroszkópia – standardizált mérési körülmények és adatfeldolgozási eljárásokkal kiegészítve – egy egyszerű, jelölésmentes módszer lehet EV-k jellemzésére. Bár főként az egyedi vezikulák jellemzésére alkalmas technikák fejlesztése került előtérbe (AFM, lézercsipeszes Raman spektroszkópia), mind orvosdiagnosztikai szempontból, mind a biokémiai jelenségek tanulmányozása céljából szükség van olyan gyors, mintaelőkészítés nélküli módszerekre, amelyek az EVk egy-egy sokaságát tudják specifikusan jellemezni.

A jelen munka során vörösvértestkoncentrátumokban (VVT) ex vivo keletkező EVket (mikrovezikulákat) vizsgáltunk IR spektroszkópiai módszerrel. Az alkalmazott ATR FT-IR technika, valamint a spektrumokból számolt fehérje-lipid arány egy robosztus karakterizálási eljárásnak bizonyult különböző jellegű EV minták megkülönböztetésére. A fehérjék másodlagos szerkezetére, illetve orientációjára utaló IR markerek szintén megfelelő „ujjlenyomatot” szolgáltatnak. A kapott eredmények felhívják a figyelmet arra, hogy bár az alapkutatásban a VVT-eredetű EVket, mint modell-vezikulákat alkalmazzák, ezek minőségére hatással vannak a vörösvértestkoncentrátumok tárolási körülményei (tárolási idő, tárolási adalék). A vérkészítményekben az öregedés/tárolás során keletkező és felgyülemlő EVk - gyulladás-indukáló hatásuk miatt - károsan befolyásolhatják a vérkészítmények további felhasználhatóságát; az IR spektroszkópia alkalmas lehet ezen EVk gyors jellemzésére.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást az NVKP_16-1-2016-0007 pályázat anyagi támogatásával végeztük.