Összes szerző

Bagosi Adrienn

az alábbi absztraktok szerzői között szerepel:

Papp Ferenc
A feszültség-kapuzott Hv1 protoncsatorna VCF jelének eredete

Aug 27 - kedd

11:25 – 11:45

Molekuláris biofizika

E10

A feszültség-kapuzott Hv1 protoncsatorna VCF jelének eredete

Papp Ferenc, Pethő Zoltán, Bagosi Adrienn, Panyi György, Varga Zoltán

Debreceni Egyegyetem, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A VCF (Voltage Clamp Fluorometry) technika egy nagyon hatékony módszer a membránpotenciál megváltozását érzékelni képes fehérjék konformáció-változásának a vizsgálatára. Ezt a technikát több labor már sikerrel alkalmazta feszültség-kapuzott ioncsatornák vizsgálatára, beleértve a Hv1-et is. Azonban csupán feltételezések vannak arra vonatkozóan, hogy mi is az oka annak, hogy a vizsgált fehérjéhez kapcsolt fluoreszcens festék által emittált fluoreszcencia intenzitásában változás történi a VCF-mérés során. A célunk az volt, hogy feltételezések helyett pontosabban meg tudjuk mondani, hogy a VCF jel mitől alakul ki, és ezáltal pontosabban megérthessük a vizsgált fehérje konformáció-változását.

A VCF méréseinket olyan Ci-Hv1 protoncsatornán végeztük, amelyben a 241-es pozícióban lévő Glu aminosav Cys-re van cserélve. Ehhez a Cys-hez kötődik az a Tamra-MTS fluoreszcens festék, amely érzékeny a lokális környezetére és ezáltal képes információt adni számunkra a fehérje konformáció-változásairól. Miután megvizsgáltuk a Hv1 csatorna aminosav-szekvenciáját, két lehetséges fluoreszcenciát kioltó aminosavat találtunk az extracelluláris oldalon. Ezeket Ala-ra mutáltuk és néztük, hogyan változik a VCF jelünk.

Bármelyik kioltó aminosavat mutáltuk Ala-ra (az Ala aminosav nem képes kioltani a fluoreszcenciát), kisebb VCF jelet mértünk. Ha mindkét fluoreszcenciát kioltó aminosavat elmutáltuk Ala-ra, semmilyen változást (jelet) nem voltunk képesek mérni. Ezek az eredményeink az jelzik, hogy a VCF jelünk kialakulásáért a Tamra-MTS festék közelében lévő fluoreszcenciát kioltó aminosavak a felelősek. További bizonyítékul szolgálhatna még, ha a fluoreszcenciát kioltó aminosavat másik, szintén kioltó aminosavra mutálnánk. Azonban már ezen ismeretek birtokában is elkezdtük egy modell kidolgozását, amelyben a legegyszerűbb, egyenes vonalú mozgását feltételezzük a Tamra festéknek a kioltó aminosavakhoz képest. Az előzetes modell-számításaink segítségével jól reprodukálhatók a mért eredményeink.

Tajti Gábor
Ioncsatorna expressziós eltérések vizsgálata in vitro polarizált T-sejteken

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

I. Poszterszekció

P26

Ioncsatorna expressziós eltérések vizsgálata in vitro polarizált T-sejteken

Tajti Gábor¹, Szántó G. Tibor¹, Csóti Ágota¹, Rácz Gréta¹, Bagosi Adrienn¹, Paholcsek Melinda², Tolnai Emese², Panyi György¹

¹ Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

² Debreceni Egyetem ÁOK, Humángenetikai Tanszék

A T-sejtek memória funkciójuk szerinti ioncsatorna (Kv1.3, KCa3.1) expressziós különbségei régóta ismertek [1], azonban az kevéssé ismeretes, hogy a T-helper-Treg altípusok között milyen eltérések fedezhetők fel. Állatkísérletes adatok utalnak különbségekre [2], humán vizsgálatok eddig azonban nem ismeretesek. Révén, hogy számtalan betegség patofiziológiájában kiemelt szerepűek egyes T-sejt altípusok, célul tűztük ki ezen sejtek ioncsatorna expressziójának jellemzését, esetleges terápiás célpontok azonosítása céljából.

Vizsgálatainkhoz egészséges önkéntesek véréből CD4⁺ T-sejteket izoláltunk, melyeket polarizáló citokin-aktivátor környezetben Th1 és Treg irányba differenciáltattunk. A sejtpopulációkat tovább dúsítottuk mágneses bead alapú eljárásokkal, majd patch-clamp és Kalcium imaging technikákkal jellemeztük azok ioncsatornáit, továbbá génexpressziós vizsgálatokat végeztünk (RT-qPCR).

Előzetes eredményeink alapján a Kv1.3 funkcionális expressziója szignifikánan magasabb a Th1 sejtekben a Treg-hez viszonyítva (914/sejt vs. 260/sejt), a KCa3.1 szintje nem mutatott ilyen különbségeket (62/sejt vs. 42/sejt). A Kv1.3 csatorna biofizikai paraméterei (aktivációs és inaktivációs időállandók, V_1/2, stb) nem különböztek. Génexpressziós szinten is felfedezhetők különbségek, a Th1 esetén a T-bet, míg a Treg esetén a FOXP3 transzkripciós faktorok a várt emelkedett expressziót mutatják, azonban az ioncsatorna gének jellemzése további adatelemzést kíván.

További terveink között szerepel a kalcium imaging mérések elemzése, mellyel a kalcium homeosztázis különbségeit kívánjuk jellemezni, valamit további T-sejt altípusok vizsgálata (Th2, Th17). Eddigi eredményeink alapján felfedezhetők expressziós különbségek a T-sejt altípusok ioncsatorna repertoárjában, mely lehetőséget adhat azok terápiás kihasználására.

Köszönetnyilvánítás

GINOP-2.3.2-15-2016-00015 I-KOM TEAMING.

Irodalom

[1] Wulff et al., J.Clin.Invest., 2003, 111:1703-1713